SNAI2作為ceRNA調(diào)控MARCKS表達(dá)促進(jìn)卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下四個(gè)部分展開(kāi)了論述：
　　第一部分 SNAI2與卵巢癌臨床病理因素的相關(guān)性及其與預(yù)后的關(guān)系
　　目的:探討SNAI2與卵巢癌臨床病理因素的相關(guān)性及其與預(yù)后的關(guān)系
　　方法:從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)提取208例漿液性卵巢癌患者的臨床資料和SNAI2的表達(dá)數(shù)據(jù)，卡法檢驗(yàn)分析SNAI2的表達(dá)與年齡、組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期和淋巴管浸潤(rùn)的相關(guān)性;同時(shí)提取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)208例漿液性卵巢癌患者和GSE26712數(shù)據(jù)集185例漿

2、液性卵巢癌患者的生存資料和SNAI2的表達(dá)數(shù)據(jù)，Log-rank分析分析SNAI2的表達(dá)與卵巢癌患者總生存期的相關(guān)性，Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖。
　　結(jié)果:SNAI2的表達(dá)和患者年齡及卵巢癌組織學(xué)分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性;SNAI2在FIGOⅢ-Ⅳ期卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于FIGOⅠ-Ⅱ期卵巢癌組織中的表達(dá)，且SNAI2高表達(dá)的卵巢癌患者更容易發(fā)生淋巴管浸潤(rùn)。在TCGA數(shù)據(jù)集中，SNAI2高表達(dá)的卵巢癌患者總生存期明顯低

3、于SNAI2低表達(dá)的卵巢癌患者(P=0.044，HR=0.65)。這一結(jié)果在GSE26712數(shù)據(jù)集中得到進(jìn)一步確認(rèn)，即SNAI2的表達(dá)與卵巢癌患者的總生存期呈明顯負(fù)相關(guān)(P=0.0017，HR=0.56)。
　　結(jié)論:SNAI2高表達(dá)是卵巢癌患者預(yù)后的一個(gè)不良因素。
　　第二部 分SNAI2相關(guān)ceRNA的篩選和鑒定
　　目的:SNAI2相關(guān)ceRNA的篩選和鑒定
　　方法:生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并結(jié)合文獻(xiàn)篩選SNAI2

4、相關(guān)ceRNA;在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI2-3'UTR，Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)干擾SNAI2-3'UTR前后候選基因表達(dá)水平的改變;選取受SNAI2-3'UTR正向調(diào)控的基因，在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)SNAI2和候選ceRNA在卵巢癌組織中的表達(dá)的相關(guān)性;Real-time PCR檢測(cè)能同時(shí)靶向SNAI2和MARCKS的miR-200c，miR-204，miR-211，mi

5、R-218和miR-429在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，選取表達(dá)量相對(duì)較高的miRNA作為候選miRNA。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析候選miRNA對(duì)MARCKS的抑制作用，以及SNAI2-3'UTR是否可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合候選miRNA誘導(dǎo)MARCKS的表達(dá)。
　　結(jié)果:生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并結(jié)合文獻(xiàn)篩選出10個(gè)SNAI2相關(guān)ceRNA，包括CDH2，F(xiàn)N1,KLF8,MARCKS,MMP2,PPARG TWIST1,

6、VIM,ZEB1和ZEB2。在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI2-3'UTR能顯著促進(jìn)MARCKS的mRNA和蛋白表達(dá)水平。相關(guān)性分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，SNAI2和MARCKS在卵巢癌組織中的表達(dá)呈明顯正相關(guān)。且在SNAI2低表達(dá)的卵巢癌組織中，MARCKS也呈低表達(dá)，而在SNAI2高表達(dá)的卵巢癌組織中，MARCKS也呈高表達(dá)。miRNA表達(dá)譜分析表明miR-218，miR-200c和miR-429在OVCA433和SKOV-

7、3細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)較高，miR-204表達(dá)相對(duì)較低，miR-211基本不表達(dá)。我們選取miR-218，miR-200c和miR-429作為候選miRNA。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明:①miR-218和miR-200c通過(guò)結(jié)合MARCKS-3'UTR種子區(qū)結(jié)合序列，顯著抑制熒光素酶的相對(duì)活性，而miR-429對(duì)熒光素酶抑制作用相對(duì)較弱;②SNAI2-3'UTR可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-218和miR-200c，抑制miR-218和miR

8、-200c的活性，逆轉(zhuǎn)其對(duì)熒光素酶的抑制作用。
　　結(jié)論:SNAI2作為ceRNA誘導(dǎo)的MARCKS表達(dá)增強(qiáng)至少部分是通過(guò)抑制miR-218和miR-200c活性介導(dǎo)的。
　　第三部分 MARCKS在卵巢癌EMT中的功能分析
　　目的:解析MARCKS在卵巢癌EMT中的作用
　　方法:用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染OVCA433和SKOV-3細(xì)胞，構(gòu)建MARCKS穩(wěn)定低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，Real-time PC

9、R和Western Blot檢測(cè)MARCKS降表達(dá)效率。羅氏實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀RTCA-CIM-Plate檢測(cè)MARCKS降表達(dá)后，卵巢癌OVCA433和SKOV-3細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移能力的改變;同時(shí)在顯微鏡下觀測(cè)干擾MARCKS表達(dá)前后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。
　　結(jié)果:在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MARCKS-shRNA后，MARCKS的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)。功能學(xué)研究表明，下調(diào)MARCKS的表達(dá)能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的

10、浸潤(rùn)和遷移能力，同時(shí)細(xì)胞的形態(tài)更趨向于上皮細(xì)胞。
　　結(jié)論:SNAI2促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT的功能至少部分是通過(guò)ceRNA作用模式，誘導(dǎo)MARCKS表達(dá)介導(dǎo)。
　　第四部分 SNAI2-3'UTR在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究
　　目的:探討SNAI2-3'UTR在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　方法:用慢病毒載體在OVCA433和SKOV-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SNAI2-3'UTR，羅氏實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀RTCA-CIM-