胞外基質(zhì)硬度調(diào)控肝癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)（簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌）是一種常見(jiàn)惡性腫瘤，該病起病隱匿，發(fā)病率和死亡率均較高。雖然近年診療技術(shù)進(jìn)步使肝癌生存率有了較大提高，但侵襲轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)依然為影響肝癌預(yù)后的主要障礙。因此，探討明確HCC侵襲轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)的分子機(jī)制將有助于肝癌診療水平的突破性進(jìn)展與提高。
　　越來(lái)越多證據(jù)顯示，腫瘤微環(huán)境參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移調(diào)控，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是細(xì)胞周邊微環(huán)境的重要組成部分，對(duì)

2、正常細(xì)胞功維持能提供結(jié)構(gòu)支撐及重要生化及物理信號(hào)。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過(guò)度沉積及構(gòu)像變化產(chǎn)生胞外基質(zhì)硬度(matrixstiffness)增加，其所產(chǎn)生的力學(xué)信號(hào)可通過(guò)破壞細(xì)胞表面力學(xué)平衡引起一系列細(xì)胞生物學(xué)行為改變。胞外基質(zhì)硬度變化可在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用:目前己知其異常增加可影響肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤預(yù)后。近年來(lái)，一些研究顯示胞外基質(zhì)硬度變化在腫瘤細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、侵襲中起重要作用。一般認(rèn)為，胞外基質(zhì)硬

3、度增加通過(guò)細(xì)胞表面整合素聚集將產(chǎn)生的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入胞內(nèi)影響細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞因子分泌;亦可通過(guò)細(xì)胞骨架重塑影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。胞外基質(zhì)硬度增加在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中的作用及機(jī)制已得到部分闡明，但其參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制目前仍知之甚少。臨床研究資料表明，80％肝癌患者有肝纖維化或肝硬化背景，且伴肝硬化的肝癌患者中位生存期明顯下降，胞外基質(zhì)硬度變化與肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。因此，聚焦胞外基質(zhì)硬度變化與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系研究，無(wú)疑會(huì)對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)

4、制最終闡明產(chǎn)生積極影響。
　　本課題旨在通過(guò)建立不同肝基質(zhì)硬度背景大鼠肝癌模型，觀察肝臟基質(zhì)硬度變化對(duì)肝癌惡性生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移的影響;同時(shí)通過(guò)建立不同基底硬度細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，探索胞外基質(zhì)硬度變化影響肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制（VEGF調(diào)控、EMT發(fā)生等），為從物理微環(huán)境角度詮釋肝癌侵襲轉(zhuǎn)移作用機(jī)制提供新理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一部分、用于研究基質(zhì)硬度影響肝癌的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)建立及不同肝基質(zhì)硬度背景大鼠肝癌模型侵襲轉(zhuǎn)移特

5、征分析
　　目的：建立用于研究基質(zhì)硬度影響肝癌的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)，分析不同肝基質(zhì)硬度背景大鼠肝癌模型侵襲轉(zhuǎn)移特征的改變。
　　方法：應(yīng)用不同劑量四氯化碳腹部皮下注射，誘導(dǎo)不同肝基質(zhì)硬度Buffalo大鼠模型，然后肝臟原位移植皮下瘤源（大鼠肝癌細(xì)胞McA-RH7777皮下注射）聯(lián)合造模，形成具有不同肝基質(zhì)硬度背景大鼠肝癌模型。對(duì)所獲模型肝癌組織基質(zhì)硬度、惡性病理特征（包括組織病理，肝功能，膠原豐度及交聯(lián)，腫瘤增殖，肺遠(yuǎn)端

6、轉(zhuǎn)移及侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)基因等）進(jìn)行分析。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)建立以聚丙烯酰胺凝膠交聯(lián)度差異呈現(xiàn)的硬度變化來(lái)模擬組織硬度改變，以基質(zhì)蛋白Ⅰ型膠原包被提供生物基質(zhì)界面，將兩者有機(jī)結(jié)合形成具有不同基底硬度的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，觀察細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)及侵襲關(guān)聯(lián)基因表達(dá)。
　　結(jié)果：隨肝基質(zhì)硬度增加，肝腫瘤生長(zhǎng)（大小、濕重）、侵襲轉(zhuǎn)移能力（肺轉(zhuǎn)移）均明顯增強(qiáng);增殖指標(biāo)Ki-67在肝癌細(xì)胞中表達(dá)增高;肝癌組織中侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)基因MMP9，MMP2，CD44，

7、SPP1，Integrinβ1表達(dá)明顯上調(diào);基質(zhì)蛋白豐度及交聯(lián)指標(biāo)COL1，LOX表達(dá)明顯上調(diào);肝基質(zhì)硬度背景不同大鼠肝癌的肝功能評(píng)估顯示，肝基質(zhì)硬度增加，肝功能變差（血清ALT，AST，ALP，GGT水平升高，白蛋白濃度降低，且肝癌組織中AFP表達(dá)升高），同時(shí)肝癌組織中Integrinβ1、FAK表達(dá)上調(diào)。體外細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)顯示，肝癌細(xì)胞隨基底硬度增加，細(xì)胞伸展面積增大，誘導(dǎo)偽足伸出，侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)基因MMP9，MMP2，CD44，SPP

8、1表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論：用于研究基質(zhì)硬度影響肝癌的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)被成功建立。高肝基質(zhì)硬度背景大鼠肝癌模型腫瘤生長(zhǎng)、惡性程度（侵襲轉(zhuǎn)移）均明顯高于低肝基質(zhì)硬度背景大鼠肝癌。生長(zhǎng)于高基底硬度表面的肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)基因表達(dá)均明顯增強(qiáng)，提示胞外基質(zhì)硬度參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控。
　　第二部分、胞外基質(zhì)硬度上調(diào)肝癌細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)及其分子調(diào)控機(jī)制
　　目的：研究胞外基質(zhì)硬度改變對(duì)肝癌細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)及其相

9、關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：檢測(cè)不同肝基質(zhì)硬度背景Buffalo大鼠肝癌組織芯片中VEGF，CD31，COL1，LOX蛋白表達(dá)情況，并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行分析;對(duì)生長(zhǎng)于不同基底硬度表面兩種肝癌細(xì)胞的VEGF表達(dá)，整合素亞型表達(dá)及PI3K-AKT信號(hào)通路變化進(jìn)行檢測(cè)分析，用特異性抗體封閉肝癌細(xì)胞表面整合素驗(yàn)證硬度信號(hào)改變胞內(nèi)信號(hào)傳遞通路的特異性。
　　結(jié)果：對(duì)組織芯片免疫組化結(jié)果分析顯示，隨著胞外基質(zhì)硬度增加，VEGF，CD31，COL

10、1，LOX的表達(dá)均明顯增加，且VEGF與COL1(r=0.533)及LOX(r=0.517)表達(dá)均呈正相關(guān);生長(zhǎng)在不同基底硬度細(xì)胞平臺(tái)的兩種肝癌細(xì)胞，其VEGF，p-PI3K，p-AKT的表達(dá)水平均隨基底硬度增加而表達(dá)水平升高，同時(shí)兩種肝癌細(xì)胞整合素亞型α5，β1增強(qiáng)最明顯。利用單克隆抗體封閉癌細(xì)胞表面integrinβ1，實(shí)驗(yàn)組VEGF，p-PI3K，p-AKT的表達(dá)水平較對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照細(xì)胞明顯降低。
　　結(jié)論：胞外基質(zhì)硬度增

11、加可通過(guò)激活整合素β1-PI3K-AKT信號(hào)途徑上調(diào)肝癌細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)血管新生。
　　第三部分、胞外基質(zhì)硬度參與肝癌細(xì)胞EMT調(diào)控及其分子機(jī)制
　　目的：研究胞外基質(zhì)硬度改變對(duì)肝癌細(xì)胞EMT的調(diào)節(jié)及其相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：對(duì)在不同基底硬度細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞MHCC97H、Hep3B的EMT相關(guān)蛋白分子進(jìn)行檢測(cè)，然后用TGF-β1分別干預(yù)肝癌細(xì)胞，進(jìn)一步檢測(cè)干預(yù)前后、及干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)肝癌細(xì)胞

12、EMT相關(guān)分子蛋白表達(dá)的改變情況及信號(hào)分子smad2/3磷酸化水平的變化情況;同時(shí)檢測(cè)分析不同基質(zhì)蛋白包被的不同基底細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)對(duì)肝癌細(xì)胞形態(tài)及snail基因有否顯著影響。
　　結(jié)果：隨著基底硬度的增加，生長(zhǎng)于其表面的兩種肝癌細(xì)胞，其上皮化標(biāo)志分子E-cadherin，β-catenin表達(dá)均明顯降低，而間質(zhì)化標(biāo)志分子N-cadherin，vimentin，α-SMA表達(dá)水平則明顯升高，提示肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化。用TGF-β1干

13、預(yù)刺激肝癌細(xì)胞，兩種細(xì)胞上述EMT相關(guān)蛋白分子與未干預(yù)對(duì)照肝癌細(xì)胞相比，變化趨勢(shì)更加顯著，且隨著基底硬度增加及TGF-β1刺激時(shí)間延長(zhǎng)肝癌細(xì)胞信號(hào)分子smad2/3活化水平明顯升高。不同基質(zhì)蛋白包被的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞，隨基底硬度增加細(xì)胞形態(tài)及snail變化基本一致，提示該體系肝癌細(xì)胞EMT發(fā)生主要來(lái)自于硬度改變，與不同基質(zhì)蛋白類(lèi)型的包被無(wú)明顯相關(guān)。
　　結(jié)論：胞外基質(zhì)硬度增加可通過(guò)smad2/3信號(hào)途徑獨(dú)立誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞E

14、MT發(fā)生。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.建立了可用于基質(zhì)硬度影響肝癌研究的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)即不同肝基質(zhì)硬度背景大鼠肝癌模型及不同基底硬度細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)。
　　2.明確胞外基質(zhì)硬度可參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)硬度增加可獨(dú)立誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT發(fā)生及上調(diào)肝癌細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)分子機(jī)制。
　　潛在應(yīng)用價(jià)值：
　　1、提供接近臨床的伴肝硬化背景肝癌狀況的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并利用肝癌基質(zhì)硬度這一物理力學(xué)參數(shù)，