靶向VEGFR-1脫氧核酶抑制血管生成及腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、現(xiàn)代腫瘤治療已經(jīng)從傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療治療模式向綜合型治療模式轉(zhuǎn)變。分子靶向藥物的作用已經(jīng)開始凸現(xiàn)，其中血管生成抑制劑通過阻斷血管形成來抑制腫瘤的生長(zhǎng)是目前應(yīng)用前景可觀的一種治療策略。脫氧核酶是基因治療技術(shù)的一種嶄新的分子生物學(xué)工具，通過將RNA分子在配對(duì)的嘧啶和未配對(duì)的嘌呤之間切斷，從而調(diào)控基因的表達(dá)。本研究通過針對(duì)VEGFR-1 mRNA設(shè)計(jì)合成10-23型脫氧核酶，觀察其在體內(nèi)外阻斷血管生成的作用，并通過小鼠黑色素瘤模型、人鼻咽

2、癌移植瘤模型評(píng)價(jià)10-23型脫氧核酶DT18的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，靶向VEGFR1的脫氧核酶具有抗腫瘤尤其是治療鼻咽癌的臨床應(yīng)用前景。
　　第一部分，
　　目的:靶向VEGFR-1 mRNA脫氧核酶的設(shè)計(jì)及生化鑒定。
　　方法:通過in silico設(shè)計(jì)針對(duì)血管內(nèi)皮生成因子受體VEGFR-1的10-23 DNAzyme。合成硫代化修飾的脫氧核酶，通過體外切割實(shí)驗(yàn)、小管形成實(shí)驗(yàn)篩選出活性良好的脫氧核酶，并以動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)分

3、析其生化活性。活性脫氧核酶經(jīng)TMP轉(zhuǎn)染HUVEC，倒置顯微鏡觀察HUVEC對(duì)FITC熒光素標(biāo)記的脫氧核酶的攝取，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，免疫印跡檢測(cè)脫氧核酶的生物學(xué)活性。
　　結(jié)果:針對(duì)不同區(qū)域的靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)了靶向VEGFR-1 mRNA序列11條，分別合成10-23 DNAzyme。通過體外切割實(shí)驗(yàn)、小管形成實(shí)驗(yàn)篩選到活性良好的脫氧核酶DT18。動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析實(shí)驗(yàn)顯示DT18對(duì)底物在50秒就開始發(fā)生作用，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，切割產(chǎn)物

4、也隨之增多。DT18經(jīng)TMP轉(zhuǎn)染后24h即可在顯微鏡下看見約50％的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率為80％;免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DT18能明顯抑制VEGFR-1的表達(dá)。相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的小管形成能力明顯減弱。
　　結(jié)論:成功篩選到活性良好的靶向VEGFR-1 mRNA的脫氧核酶。
　　第二部分，
　　目的:體內(nèi)水平探討10-23脫氧核酶DT18抑制血管新生的生物學(xué)效應(yīng)。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為三組:脫氧核酶

5、組(DT18 group)、寡核苷酸對(duì)照組（INV-Ctrl group）和生理鹽水組(saline group)。通過角膜微囊袋法建立鼠角膜血管形成模型，在顯微鏡下觀察DT18對(duì)角膜新生血管面積和數(shù)量的影響;建立黑色素瘤細(xì)胞B16移植瘤小鼠腫瘤模型，觀察DT18是否通過靶向VEGFR-1影響腫瘤生長(zhǎng);DT18細(xì)胞轉(zhuǎn)染入B16細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DT18對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:DT18明顯抑制了角膜血管的新生，相對(duì)于生理鹽水

6、組，實(shí)驗(yàn)組減少了72％的血管面積和61％的血管數(shù)量。與對(duì)照組、生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。成功構(gòu)建血管豐富且VEGFR-1高表達(dá)的黑色素瘤移植鼠模型。利用該模型，DT18明顯抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，相對(duì)于對(duì)照組與生理鹽水組，各組腫瘤體積的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。利用轉(zhuǎn)染試劑Fugene成功將DT18細(xì)胞轉(zhuǎn)染入B16細(xì)胞，48h后在熒光顯微鏡下可見到80％的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)DT18不影響細(xì)胞的增

7、殖(P＞0.05)。
　　結(jié)論:成功建立了鼠角膜血管形成模型、黑色素瘤小鼠模型;并以體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證了經(jīng)過硫代化修飾的10-23 DNAzyme DT18通過靶向VEGFR-1明顯抑制血管新生，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。
　　第三部分，
　　目的:利用分子影像學(xué)手段探討靶向VEGFR1、脫氧核酶對(duì)鼻咽癌移植瘤血管通透性和血管生成的影響。
　　方法:將鼻咽癌移植瘤裸鼠模型隨機(jī)分為3小組:脫氧核酶組(DT18 group)、

8、寡核苷酸對(duì)照組(INV-Ctrl group)、生理鹽水組(salinegroup)。待腫瘤體積長(zhǎng)至60-100mm3后進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射用藥，腫瘤內(nèi)每周兩次多點(diǎn)注射20μl的注射液，包含3μl的fugene和100μg的DT18（或生理鹽水或者INV-CONTROL），共給藥7次，第18天終止實(shí)驗(yàn)，期間測(cè)量腫瘤大小和小鼠體重。并于干預(yù)結(jié)束后行常規(guī)MRI和DCE-MRI，獲得移植瘤腫瘤組織的Ktrans值。移植瘤標(biāo)本分別行VEGFR1免疫組

9、化染色。
　　結(jié)果:反映腫瘤血管通透性的Ktrans值在脫氧核酶處理組與寡核苷酸對(duì)照組、生理鹽水組與移植瘤腫瘤組的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較P=0.028，實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水組比較P=0.026）。脫氧核酶處理組與寡核苷酸對(duì)照組、生理鹽水組移植瘤體積變化的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果表明，脫氧核酶處理組VEGFR1表達(dá)顯著低于，寡核苷酸對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組。
　　結(jié)論:結(jié)合免疫組化和Ktrans值

10、證實(shí)靶向VEGFR1 mRNA脫氧核酶可導(dǎo)致鼻咽癌移植瘤血管生成和血管通透性下降，移植瘤腫瘤體積減小。其病理生理學(xué)基礎(chǔ)是靶向VEGFR1脫氧核酶在移植瘤內(nèi)能夠通過抑制VEGFR1的表達(dá)來抑制血管新生，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。Ktrans值可為探討靶向EBV-VEGFR1 mRNA脫氧核酶進(jìn)行鼻咽癌的臨床實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第四部分，
　　目的:靶向VEGFR-1 mRNA脫氧核酶DT18的藥代動(dòng)力學(xué)及安全性初步評(píng)價(jià)。
　

11、　方法:1.藥代動(dòng)力學(xué)分析:32P標(biāo)記的DT18(1mg/ml200 l)通過尾靜脈注射Balb/c鼠，注射劑量為10mg/kg，，在不同的時(shí)間點(diǎn)（3只鼠/時(shí)間點(diǎn)）分別通過眼眶靜脈叢穿刺采血法抽取0.5 ml外周血。離心獲取血清，并通過苯酚/氯仿萃取DT18。用Southern印跡和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)DT18濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)通過軟件計(jì)算。
　　2.毒理分析:將30只Balb/C鼠隨機(jī)分為生理鹽水組（Saline組10只）、

12、對(duì)照組（INV-Ctrl組10只）和實(shí)驗(yàn)組（DT18組10只），每只老鼠均給予單次尾靜脈注射，DT18組和INV-Ctrl組劑量為20mg/kg。給藥2周內(nèi)評(píng)估各組老鼠的體重變化、攝食情況，兩周后收集小鼠外周血液，行血常規(guī)、肝腎功能、免疫功能檢查，檢測(cè)主要臟器指數(shù)并行主要臟器病理學(xué)檢查。
　　結(jié)果:1.DT18以10 mg/kg的劑量經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)期間大鼠未見明顯異常行為。通過藥代動(dòng)力學(xué)軟件計(jì)算，分布半衰期為0.1h

13、r，消除半衰期為46.7hr，最大血藥濃度為84.4 mg/ml，藥物濃度-時(shí)間曲線下面積為97mg/ml hr，表觀分布體積為890ml/kg。
　　2.各組大鼠在給藥期間和恢復(fù)期未出現(xiàn)毒性反應(yīng)和死亡現(xiàn)象，DT18組體重變化、臟器指數(shù)、攝食情況、血常規(guī)、肝腎功能、淋巴細(xì)胞CD3+/CD4+/CD8+比例以及主要臟器病理檢查與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:DT18具有良好的較好的藥物耐受性和安全