靶向脫氧核酶抑制鼻咽癌EBV-LMP1基因表達的實驗研究.pdf

1、鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是耳鼻喉喉頭頸外科常見惡性腫瘤，好發(fā)于我國南方及東南亞地區(qū)。病因?qū)W研究表明，鼻咽癌的發(fā)病與EB病毒感染、遺傳易感性、飲食習(xí)慣及某些環(huán)境理化因素有關(guān)，其發(fā)生也是一個多基因參與、多步驟的復(fù)雜過程，其中，EB病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）扮演重要角色。在EB病毒編碼的眾多蛋白當(dāng)中，潛伏膜蛋白1（latent membrane protein1，L，MP1）

2、是目前唯一證實的惡性轉(zhuǎn)化基因。脫氧核酶（deoxyribozyme，DNAzyme，DZ）技術(shù)作為一種新型的基因治療工具，能有效抑制目的基因表達，已廣泛應(yīng)用于腫瘤、病毒的基因治療研究當(dāng)中。本課題針對EBV-LMP1mRNA，設(shè)計并合成具有高效抑制性及特異性的脫氧核酶，觀察其對鼻咽癌細胞及裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型中EBV-LMP1基因表達的抑制作用以及對鼻咽癌細胞產(chǎn)生的生物學(xué)影響，為鼻咽癌的預(yù)防和臨床治療提供新的基因治療策略。
　　

3、 第一部分、脫氧核酶抑制鼻咽癌細胞EBV-LMP1基因表達的研究
　　 目的：根據(jù)前期研究結(jié)果，合成高效特異抑制EBV-LMP1基因表達的靶向脫氧核酶，并觀察其對鼻咽癌細胞內(nèi)靶基因的抑制效應(yīng)。
　　 方法：以EBV-LMP1基因為抑制靶點，合成脫氧核酶DZ509（經(jīng)前期細胞外分子水平切割篩選，證明具有高效性和特異性）、以及相對應(yīng)的突變體mutDZ509（15nt堿基活性中心第4位點突變）和反義寡核苷酸ASODN509（

4、有相同底物識別序列但無酶活性），5’端用FITC標(biāo)記，并進行硫代化修飾，經(jīng)脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染C666-1細胞，命名為DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組。同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染空白對照組及僅轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體對照組。轉(zhuǎn)染后24h，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。采用RT-PCR、Western Blot方法檢測其抑制LMP1mRNA和蛋白表達的效率。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染后24h，DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組轉(zhuǎn)染效率分別

5、為64％、60％及65％。RT-PCR結(jié)果顯示：與空白對照組相比，脂質(zhì)體對照組對EBV-LMP1mRNA表達抑制率為5.94％，差異無顯著性（P>0.05）；而ASODN509、mutDZ509、DZ509都能不同程度抑制EBV-LMP1基因表達，其抑制率分別為23.33％、53.18％、68.76％，其抑制效應(yīng)：ASODN509

6、.05；DZ509組與ASODN509組相比，P<0.01；mutDZ509組與ASODN509組相比，P<0.05。Western Blot檢測結(jié)果與RT-PCR基本一致。與空白對照組相比，脂質(zhì)體組對EBV-LMP1蛋白表達抑制率為1.68％，差異無顯著性（P>0.05）；ASODN509、mutDZ509、DZ509都能不同程度抑制EBV-LMP1蛋白表達，抑制率各為22.14％、50.39％、68.21％，其抑制效應(yīng)：ASODN5

7、09　　 結(jié)論：與mutDZ509、ASODN509相比，DZ509能高效抑制鼻咽癌細胞中EBV-LMP1基因表達，為進一步體內(nèi)實驗提供基礎(chǔ)。
　　 第二部分、 EBV-LMP1靶向脫氧核酶對鼻咽

8、癌細胞生物學(xué)特性的影響
　　 目的：探討靶向脫氧核酶對鼻咽癌細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響。
　　 方法：將脫氧核酶DZ509、相對應(yīng)的突變體mutDZ509、無酶活性的反義寡核苷酸ASODN509經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至C666-1細胞，分別命名為DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組。同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染空白對照組及僅轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體對照組。轉(zhuǎn)染后24h、48h及72h，采用MTT法檢測各實驗組細胞的增殖情況。轉(zhuǎn)染后24h，

9、采用流式細胞儀檢測各實驗組細胞的細胞周期；采用流式細胞術(shù)Annexin V-FITC/PI檢測各實驗組細胞的凋亡情況。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24h，與空白對照組相比，脂質(zhì)體組細胞增殖抑制率為5％，差異無顯著性（P>0.05）；DZ509組、mutDZ509組和ASODN509組細胞增殖抑制率分別為31％、16％、14％，組間比較差異有顯著性（P<0.05），抑制效應(yīng)：ASODN509

10、轉(zhuǎn)染后48h，DZ509、mutDZ509、ASODN509對細胞增殖抑制明顯減弱，抑制率分別為19％、7％和6％，其中，DZ509組與mutDZ509組、ASODN509組比較，差異有顯著性（P<0.05），mutDZ509組與ASODN509組相比，差異無顯著性（P>0.05）。轉(zhuǎn)染后72h結(jié)果與48h基本一致。
　　 轉(zhuǎn)染后24h，流式細胞儀檢測C666-1細胞周期，結(jié)果顯示：對于G0/G1期比率，與空白對照組50.28％

11、相比，脂質(zhì)體組為55.23％，差異無顯著性（P>0.05），DZ509組為68.46％，差異有顯著性（P<0.05）、mutDZ509組、ASODN509組分別為63.72％和62.23％，差異無顯著性（P>0.05），其中DZ509組和mutDZ509組、ASODN509組比較，差異無顯著性（P<0.05）。mutDZ509組與ASODN509組比較，差異無顯著性（P>0.05）；對于S期所占比率，與空白對照組39.30％相比，脂質(zhì)體

12、組為33.72％，差異無顯著性（P>0.05）；DZ509組為12.37％，差異有顯著性（P<0.05）；mutDZ509組、ASODN509組分別為27.05％和28.77％，差異無顯著性（P<0.05），其中DZ509組和mutDZ509組、ASODNS09組比較，差異有顯著性（P<0.05）。mutDZ509組與ASODN509組比較，差異無顯著性（P<0.05）。
　　 流式細胞儀檢測并計算凋亡率，轉(zhuǎn)染后24h，與空白對

13、照組相比，脂質(zhì)體組細胞凋亡率為0.48％，差異無顯著性（P<0.05）；DZ509、mutDZ509、ASODN509組細胞凋亡率約為16.64％、10.47％、8.81％，其凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)：ASODN509　　 結(jié)論：較mutDZ509、ASODN509相比，DZ509能明顯抑制鼻咽癌細胞增殖，使細胞生長停滯于G0-G1期，DNA合成減少，并誘導(dǎo)細胞凋亡。
　

14、　 第三部分、 EBV-LMP1靶向脫氧核酶對裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤生長的影響
　　 目的：建立裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型；觀察靶向脫氧核酶、突變脫氧核酶及反義寡核苷酸對移植瘤生長及LMP1表達的影響。
　　 方法：將鼻咽癌細胞C666-1種植于裸鼠皮下，觀察腫瘤生長情況。成瘤后，將裸鼠隨機分為DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組、PBS組，每組各7只，每天于瘤體內(nèi)分別多點注射脫氧核酶DZ509、突變體mu