刺參腐皮綜合癥相關(guān)microRNA調(diào)控機(jī)制初探.pdf

1、腐皮綜合癥是刺參（Apostichopus japonicus）養(yǎng)殖中最常見的疾病之一，已成為制約刺參養(yǎng)殖行業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的主要限制因素。目前，多種病原已在不同地區(qū)發(fā)病刺參中被分離獲得，但對于不同病原感染刺參過程中的腐皮綜合癥發(fā)生機(jī)制的研究卻知之甚少。microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小 RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制 mRNA翻譯或誘導(dǎo) mRNA降解，從而在免疫反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，是研究宿主與病原互作的重

2、要調(diào)節(jié)因子。
　　本文立足于刺參腐皮綜合癥關(guān)鍵調(diào)控 miRNA分子，應(yīng)用高通量的RNA-seq手段與iTRAQ蛋白質(zhì)組技術(shù)，篩選其靶基因，同時應(yīng)用生物信息學(xué)分析與雙熒光素酶報告系統(tǒng)，驗證 miRNA與其靶基因具有調(diào)控關(guān)系，以腐皮綜合癥病原之一燦爛弧菌（Vibrio splendidus）作為模擬病原，在細(xì)胞及個體水平上對miRNAs在宿主與病原互作中進(jìn)行功能解析，以期為刺參腐皮綜合癥的分子治療提供理論基礎(chǔ)。研究成果如下：
　

3、?。?）構(gòu)建了腐皮綜合癥發(fā)生前后刺參體腔細(xì)胞的均一化 cDNA文庫和數(shù)字表達(dá)基因文庫，高通量測序和生物信息學(xué)分析獲得了4,858個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因2,163個，下調(diào)表達(dá)基因2,695個。從中識別了包括 miR-2008、miR-137以及miR-92a等在內(nèi)的miRNA的靶基因；
　?。?）發(fā)展了雜交PCR篩選miR-92a靶基因的新體系，成功注釋了miR-92a的潛在靶基因10個，結(jié)合RNA-seq獲得的23個mi

4、R-92a靶基因，從中發(fā)現(xiàn)了SMURF、MEGF和PCBP等三個共同靶基因。探究了在燦爛弧菌以及LPS脅迫下，刺參miR-92a及其預(yù)測靶基因的的體內(nèi)和體外表達(dá)模式變化，進(jìn)一步確認(rèn)了MEGF及SMURF作為miR-92a的靶基因的可能性。
　?。?）完成了iTRAQ基礎(chǔ)上的病原燦爛弧菌感染刺參過程中的體腔細(xì)胞全蛋白組的定量分析，成功注釋了相關(guān)表達(dá)蛋白2,049個（FDR<1.0％），篩選出差異表達(dá)蛋白228個，其中129個蛋白下調(diào)

5、表達(dá)，融合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，識別了miR-2008靶蛋白8個，miR-137的靶蛋白9個；
　?。?）建立了刺參個體和體外培養(yǎng)細(xì)胞兩個層次上的miRNA和靶基因功能鑒定體系，系統(tǒng)闡明了刺參 miR-137和miR-2008分化靶向甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（BHMT）介導(dǎo)細(xì)胞 ROS產(chǎn)生抵御病原微生物感染的新機(jī)制。通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定了BHMT3’UTR中miR-137和miR-2008各具一個功能結(jié)合位點。結(jié)合定量PCR與Wes