SARS冠狀病毒特異性B細(xì)胞表位的篩選及免疫學(xué)特性研究.pdf

1、背景：SARS coronavirus(SARS-CoV)感染引起嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(Severe AcuteRespiratory Syndrome，SARS)的全球爆發(fā)嚴(yán)重危害了人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)。對(duì)SARS-CoV的研究主要集中于病原的致病機(jī)制、SARS的源頭和傳播途、防治藥物和疫苗的研制和開(kāi)發(fā)。對(duì)于這種新現(xiàn)病毒，病毒抗原表位的研究是SARS-CoV眾多研究的基礎(chǔ)。SARS-CoVB細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位的確定及對(duì)其免疫學(xué)特性的研究將為S

2、ARS特異性診斷試劑的研制、疫苗和抗病毒藥物的設(shè)計(jì)與合成奠定基礎(chǔ)。目的：篩選SARS-CoV B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，對(duì)其進(jìn)行特異性和敏感性檢測(cè)、抗體效價(jià)測(cè)定等一系列免疫學(xué)特性研究，分析各表位的潛在應(yīng)用前景，為SARS特異性診斷試劑、SARS疫苗和抗病毒藥物的研制奠定基礎(chǔ)。 方法：應(yīng)用隨機(jī)噬菌體展示肽庫(kù)，以SARS恢復(fù)期病人IgG Fab段及正常人IgG Fab段為篩選靶標(biāo)，經(jīng)改良的生物淘洗方式，結(jié)合生物信息學(xué)方法，篩選SARS-CoV

3、特異性B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位；人工合成表位多抗原肽(MAPs)，ELISA法檢測(cè)其特異性和敏感性；以表位肽免疫BALB／c小鼠，ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)和特異性，研究表位肽誘導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答；經(jīng)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、ELISPOT分析IL-4和IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)目變化、流式細(xì)胞技術(shù)分析脾淋巴細(xì)胞亞群變化和表位肽誘導(dǎo)CD4<'+>T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫記憶來(lái)研究表位肽誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答；經(jīng)吞噬功能的檢測(cè)研究表位肽誘導(dǎo)的非特異性免疫應(yīng)答；通過(guò)E

4、LISA法和噬菌體滴度測(cè)定觀察表位介導(dǎo)的吸附作用以及特異性抗體對(duì)吸附的阻斷作用。 結(jié)果： 1．經(jīng)過(guò)2次4輪改良的生物淘洗，共篩選到9個(gè)SARS-CoVS蛋白表位和2個(gè)M蛋白表位。 2．經(jīng)生物信息學(xué)分析，其中的7個(gè)表位即S91-102、S424-435、S458-469、S785-796、 S1065-1076、M148-159、M165-176分別為SARS-CoVS和M蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。合 成6個(gè)表位MA

5、P肽(MAPl—MAP6，分別為S91-102、S424-435、S458-469、 S1065-1076、M148-159和M165-176)作進(jìn)一步研究。競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示各表位 肽均可抑制相應(yīng)的噬菌體克隆與SARS恢復(fù)期病人IgG Fab段結(jié)合，最大抑制率為54 ％～86％，表明這些表位肽與其相應(yīng)的噬菌體克隆可不同程度地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗 SARS-CoVIgG Fab段的同一位點(diǎn)，證實(shí)了與抗SARS-CoVIgG Fab段結(jié)合

6、的表位肽的 位點(diǎn)為SARS-CoyB細(xì)胞表位。 3．免疫學(xué)特性研究： (1)表位肽均能與SARS病人血清發(fā)生特異性反應(yīng)，不與正常人血清、抗人冠狀病毒 OC43(HCoV-OC43)血清和229E(HCoV-229E)血清發(fā)生交叉反應(yīng)，具有SARS-(Coy特異性。與SARS病人血清反應(yīng)時(shí)，表位肽S458-469，S91-102，S1065-1076和M148-159具有較高的敏感性。 (2) 表位肽誘導(dǎo)的

7、特異性體液免疫應(yīng)答：這些表位肽均能刺激小鼠產(chǎn)生高效價(jià) (1∶1280～1∶5120)特異性抗體，MAP1、MAP2、MAP4這3個(gè)S蛋白表位肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)高于M蛋白表位肽誘導(dǎo)者。這些抗體能特異地與SARS-CoV滅 活抗原反應(yīng)而不與HCoV-OC43和HCoV-229E抗原反應(yīng)。 (3)表位肽誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答： ①免疫第14天，小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞明顯增生，T淋巴細(xì)胞相對(duì)減少，導(dǎo)致T／B比值明顯下降。隨T細(xì)胞

8、增殖，T／B比值逐漸回復(fù)(除MAP2組)。發(fā)現(xiàn)MAP2免疫能引起短暫的T8細(xì)胞抑制，導(dǎo)致T4／T8比值明顯高于對(duì)照組，并于第21天恢復(fù)正常，其余多肽免疫組T4／T8與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，提示脾淋巴系統(tǒng)處于相對(duì)免疫 穩(wěn)態(tài)。 ②首次免疫后8周，小鼠CD4<'+>T細(xì)胞出現(xiàn)CD44<'high>CD62L<'low>的記憶細(xì)胞表型，再次接 觸相同抗原，MAP3免疫組CD4<'+>T細(xì)胞CD44表達(dá)輕微上調(diào)，其余組均輕微下調(diào)，隨后

9、處于高表達(dá)狀態(tài)；CD62L表達(dá)連續(xù)上調(diào)，提示CD4<'+>T細(xì)胞免疫記憶形成。 ③各表位肽均可刺激淋巴細(xì)胞不同程度增生，最大刺激指數(shù)22.0％～47.6％。S蛋白表位肽刺激淋巴細(xì)胞增生的程度大于M蛋白表位肽刺激者。 ④各表位肽均能刺激IL-4和IFN-γ分泌細(xì)胞增多，峰值分別為56～124個(gè)/2×10<'5>個(gè)淋巴細(xì)胞和14～20個(gè)/2×10<'5>個(gè)淋巴細(xì)胞，前者明顯多于后者。S蛋白表位肽刺激IL-4分泌細(xì)胞多

10、于M蛋白表位肽刺激者。 (4)表位肽誘導(dǎo)的非特異性免疫應(yīng)答：各表位肽均能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。 (5)展示SARS-CoVS91-102、S424-435和S458-469表位的噬菌體可不同程度地吸附Vero，Vero-E6，MDCK，Hep-2細(xì)胞，其特異性抗體可阻斷表位介導(dǎo)的吸附作用。 結(jié)論：本研究以SARS恢復(fù)期病人血清為篩選材料，應(yīng)用噬菌體展示肽技術(shù)，通過(guò)改良的生物淘洗方法，篩選出9

11、個(gè)SARS-CoVS蛋白表位和2個(gè)M蛋白表位，表明SARS-CoVS蛋白和M蛋白為SARS-CoV的重要抗原成分。結(jié)合生物信息學(xué)方法在篩得的11個(gè)表位中選擇6個(gè)優(yōu)勢(shì)表位，以ELISA、ELISPOT、流式細(xì)胞技術(shù)等免疫學(xué)方法研究這些表位的免疫學(xué)特性，結(jié)論如下：各表位肽誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答以體液免疫為主，刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)抗體，證實(shí)這些表位為B細(xì)胞表位；其中S蛋白表位肽誘導(dǎo)的特異性抗體效價(jià)高于M蛋白表位肽誘導(dǎo)者，提示它們?cè)诒砦灰呙缁蛞呙缪兄?/p>

12、中的潛在應(yīng)用前景；所篩表位具有SARS-CoV特異性，其中S458-469、S91-102、S1065-1076和M148-159具有較高的敏感性，此外，抗表位肽抗體具有特異性，可通過(guò)制備高效價(jià)免疫血清或單克隆抗體(McAb)用于特異性診斷，提示了這些表位在研制特異性診斷試劑中的潛在應(yīng)用價(jià)值；表位S91-102、S424-435和S458-469可介導(dǎo)噬菌體對(duì)SARS-CoV宿主細(xì)胞的吸附，其特異性抗體可阻斷吸附作用，提示它們可能為研究