卵形鯧鲹ToPrx1和ToTrx1基因的特征和功能研究.pdf

1、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）肉質(zhì)鮮美，肌間刺少，蛋白含量高，是優(yōu)質(zhì)食用魚。卵形鯧鯵可飼喂人工配合飼料，適合深水抗風(fēng)浪網(wǎng)箱養(yǎng)殖和池塘養(yǎng)殖，已成為我國華南沿海最重要的海水養(yǎng)殖魚類之一，近年來的年產(chǎn)量已接近10萬噸。然而，由于在長期的人工繁育過程中未對親本進(jìn)行選育，導(dǎo)致卵形鯧鲹養(yǎng)殖群體抗病（逆）能力下降，在遇到環(huán)境脅迫時易導(dǎo)致病害爆發(fā)，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，目前亟需深入研究卵形鯧鲹響應(yīng)環(huán)境脅迫的免疫調(diào)控分子機(jī)制，為卵形

2、鯧鯵抗病（逆）新品種培育和免疫防治技術(shù)的建立提供理論依據(jù)。有大量的研究表明，過氧化物還原酶和硫氧還蛋白在保護(hù)機(jī)體免受活性氧（ROS）毒害方面具有十分重要的作用。本研究在前期轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得了卵形鯧鲹免疫相關(guān)基因過氧化物還原酶1（ToPrx1）和硫氧還蛋白1（ToTrx1）cDNA序列的基礎(chǔ)上，分別分析了ToPrx1和ToTrx1系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；利用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測了ToPrx1和ToTrx1在卵形鯧鲹不同組織中的表達(dá)模式；研

3、究了ToPrx1和ToTrx1對卵形鯧鲹感染美人魚發(fā)光桿菌的免疫調(diào)控作用；對卵形鯧鲹ToPrx1和ToTrx1兩種蛋白進(jìn)行體外重組表達(dá)，研究了兩種重組蛋白的抗氧化活性，取得的主要結(jié)果如下：
　　1.卵形鯧鲹過氧化物還原酶1
　　過氧化物還原酶1（Prx1）是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化蛋白，它可以保護(hù)機(jī)體免受活性氧等的侵害。本實驗通過隨機(jī)測序卵形鯧鲹 cDNA文庫獲得了卵形鯧鲹Prx1（ToPrx1）cDNA序列，全長1049b

4、p，5’端非編碼區(qū)127bp，3’端非編碼區(qū)328bp，有一個編碼197個氨基酸多態(tài)的開放閱讀框，為549bp；多重序列比對發(fā)現(xiàn)ToPrx1蛋白與其它物種的已知Prx蛋白具有很高的同源性（79-92％），并且ToPrx1包含了保守了Prx結(jié)構(gòu)域和過氧化物酶活性中心；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，卵形鯧鲹ToPrx1聚在硬骨魚Prx1簇，為典型2-Cys型Prx；卵形鯧鲹ToPrx1 mRNA在受檢測的心、胃、鰓等13個組織中都有不同程度的表達(dá)，在背

5、鰭組織中表達(dá)量最高，在脾、腎臟、腸道、眼、鰓和血液中依次降低；對卵形鯧鲹進(jìn)行美人魚發(fā)光桿菌侵染實驗后發(fā)現(xiàn)，ToPrx1 mRNA在免疫相關(guān)組織肝、脾、腎和腸道中在不同時間點，都呈現(xiàn)不同程度的極顯著上調(diào)；對卵形鯧鲹ToPrx1蛋白進(jìn)行了體外重組表達(dá)，得到融合蛋白rToPrx1，并通過Ni-NTA HisBind進(jìn)行純化復(fù)性，最后通過Western blotting技術(shù)進(jìn)行了鑒定；對rToPrx1融合蛋白進(jìn)行活性研究，證實了rToPrx1為

6、巰醇依賴性蛋白，具有明顯的抗氧化活性。
　　2.卵形鯧鲹硫氧還蛋白1
　　硫氧還蛋白1（Trx1）是保持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境氧化還原平衡的關(guān)鍵因素。本實驗通過隨機(jī)測序卵形鯧鲹cDNA文庫，通過比對分析得到了卵形鯧鲹硫氧還蛋白1（ToTrx1）的cDNA序列，該cDNA序列全長786bp，開放閱讀框324 bp，編碼107個氨基酸多肽，5’非編碼區(qū)有116 bp，3’非編碼區(qū)346bp；卵形鯧鲹ToTrx1序列與其它物種已知Trx序

7、列進(jìn)行多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)，ToTrx1含有一個硫氧還蛋白家族高度保守的二硫鍵/巰基活性位點CGPC；卵形鯧鲹ToTrx1 mRNA在受檢測的心、胃、鰓、腦等13個組織中均有不同程度的表達(dá)，并在胃、鰓和背鰭組織中達(dá)到最大；對卵形鯧鲹進(jìn)行美人魚發(fā)光桿菌侵染實驗后發(fā)現(xiàn)，ToTrx1 mRNA在卵形鯧鲹免疫相關(guān)組織肝、脾、腎和腸道中，在不同時間點分別呈現(xiàn)出極顯著上調(diào)；接著對卵形鯧鲹ToTrx1進(jìn)行體外重組表達(dá)，得到融合蛋白rToTrx1，并且

8、通過Ni-NTA HisBind樹脂進(jìn)行純化復(fù)性，通過Western blotting檢測過后，最終得到具有活性的目的融合蛋白rToTrx1；最后通過胰島素減少實驗對融合蛋白rToTrx1的二硫鍵還原活性進(jìn)行了檢測，證明了rToTrx1具有明顯活性。
　　本研究對卵形鯧鲹ToPrx1和ToTrx1基因序列進(jìn)行了分析，克隆表達(dá)得到了卵形鯧鲹的rToPrx1和rToTrx1融合蛋白，驗證了他們的蛋白活性及功能，同時探究了ToPrx1和