卵形鯧鲹分子標(biāo)記的篩選與應(yīng)用.pdf

1、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）具有生長速度快，食性簡單，肉質(zhì)鮮美，容易飼養(yǎng)等一系列優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為我國華南沿海地區(qū)一種重要的海水養(yǎng)殖品種。由于目前卵形鯧鲹未經(jīng)過人工選育，在繁、育過程中隨機(jī)挑取親本可能導(dǎo)致近交衰退，因此急需評(píng)價(jià)卵形鯧鲹育種群體的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)，為在遺傳選育中親本選擇和配對(duì)策略的制定提供參考依據(jù)。本研究采用FIASCO法構(gòu)建了卵形鯧鲹微衛(wèi)星（Microsatellite, SSR）富集文庫，測序篩

2、選到21個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，利用篩選的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)評(píng)價(jià)了廣東大亞灣和海南三亞兩個(gè)育種群體遺傳多樣性水平和種群遺傳結(jié)構(gòu)，為育種群體親本配對(duì)策略的制定提供了依據(jù)；測序獲得了卵形鯧鲹線粒體基因組DNA，利用卵形鯧鲹線粒體基因組DNA序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的6種鲹科魚類線粒體基因組DNA序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究；由于從形態(tài)上很難區(qū)分卵形鯧鲹雌雄個(gè)體，給遺傳育種過程中雌雄親本的配對(duì)帶來了很大的困難，為了建立雌雄個(gè)體的分子識(shí)別技

3、術(shù)，本研究嘗試?yán)肁FLP和RAPD技術(shù)對(duì)卵形鯧鲹雌雄個(gè)體進(jìn)行了全基因組掃描，以期篩選雌雄個(gè)體特異的分子標(biāo)記。本研究取得的主要結(jié)果如下：
　　(1)卵形鯧鲹微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選
　　使用“磁珠富集法”建立了卵形鯧鲹微衛(wèi)星序列富集文庫，篩選文庫中的陽性克隆進(jìn)行測序分析，共獲得了約450個(gè)菌落的微衛(wèi)星富集文庫，得到320個(gè)陽性克隆，測序其中的219個(gè)克隆，有150個(gè)克?。?8.5﹪）含有重復(fù)次數(shù)≧5微衛(wèi)星序列；利用這些序列共設(shè)計(jì)了1

4、37對(duì)微衛(wèi)星引物，其中108對(duì)引物成功擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，利用48個(gè)卵形鯧鲹個(gè)體評(píng)價(jià)這些微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果表明其中21個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有多態(tài)性，該群體的等位基因數(shù)Na為2-10，觀測雜合度HO為0.083-0.792，平均為0.585，期望雜合度He為0.081-0.886，平均為0.589，多態(tài)性信息含量PIC為0.0767-0.8623；6個(gè)位點(diǎn)(TO33，TO47，TO67，TO80，TO132-1，TO145)明顯偏離HE

5、W（P<0.01）。
　　(2)2個(gè)卵形鯧鲹育種群體遺傳多樣性比較分析
　　利用篩選的21個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中的11個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)海南三亞和廣東大亞灣2個(gè)育種群體進(jìn)行了遺傳多樣性比較分析，研究結(jié)果表明廣東大亞灣和海南三亞2個(gè)卵形鯧鲹育種群體的平均等位基因Na分別為5.0和3.6，平均有效等位基因Ne為2.965和2.244，觀測雜合度Ho分別為0.292-0.814和0.207-0.840，期望雜合度He分別為0.307-

6、0.813和0.189-0.761，海南三亞群體中多態(tài)信息含量PIC為0.014-0.719，平均為0.509，廣東大亞灣群體的PIC為0.168-0.711，平均為0.436。海南三亞群體有5個(gè)位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡（P<0.05），廣東大亞灣群體有2個(gè)位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡；2個(gè)群體間的遺傳相似系數(shù)為0.561，遺傳距離為0.578，遺傳分化指數(shù)（Fst）為0.152。聚類分析和Structure軟件分析顯示海南三亞和廣東大亞灣

7、2個(gè)卵形鯧鲹群體各為一支，2個(gè)群體間具有較大的遺傳分化，可作為2個(gè)育種群體管理，2個(gè)群體間進(jìn)行雜交選育預(yù)期可獲得較好的遺傳進(jìn)展。
　　(3)卵形鯧鲹性別特異性分子標(biāo)記的篩選
　　利用AFLP和RAPD技術(shù)進(jìn)行卵形鯧鲹雌雄個(gè)體的全基因組掃描，以期獲得雌雄個(gè)體特異分子標(biāo)記。利用64對(duì)AFLP引物組合，共擴(kuò)增出2322個(gè)位點(diǎn)，其中18個(gè)引物組合（26.6％）產(chǎn)生可能與性別相關(guān)聯(lián)的擴(kuò)增，未篩選到雌雄個(gè)體特異的分子標(biāo)記；利用238條R

8、APD引物篩選雌雄特異的分子標(biāo)記，共有26個(gè)隨機(jī)引物產(chǎn)生可能與性別相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，也未篩選到卵形鯧鲹雌雄個(gè)體特異性的DNA標(biāo)記。
　　(4)卵形鯧鲹線粒體全基因組克隆及鲹科魚類發(fā)育關(guān)系分析
　　根據(jù)鲹科魚類線粒體序列同源性設(shè)計(jì)10組引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序分析，獲得了卵形鯧鲹線粒體基因組DNA序列，線粒體基因組的大小為16564bp，其中包含13個(gè)蛋白編碼基因，2個(gè)核糖體RNA基因（12SrRNA和16SrRNA），22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)

9、RNA基因以及一個(gè)D-loop區(qū)域，絕大部分基因?yàn)橹劓?，只有NADH脫氫酶亞基6（ND6）和8種tRNA（Gln，Ala，Asn，Cys，Try，Glu，Pro，Ser）以輕鏈形式編碼蛋白，與另外一個(gè)發(fā)表于NCBI的序列（KF356397）相比，兩個(gè)序列的同源性為99﹪，只有在16SrRNA和Control region區(qū)域有較大的差異，分別占0.17％和1.7％，由于具有較大的序列差異，這2個(gè)基因能夠?yàn)楹笃诼研析K鲹種群結(jié)構(gòu)的研究提供理