急性移植物抗宿主病狀態(tài)下骨髓血管niche缺陷及其對造血干-祖細胞的影響.pdf

1、異基因造血干細胞移植(allogeneichematopoieticstemcellstransplantation；allo-HSCT)是目前用于治療良、惡性血液病、聯(lián)合免疫缺陷病和某些自身免疫性疾病及一些實體腫瘤等疾病的重要手段。急性移植物抗宿主病(acutegraft-versus-hostdisease；aGVHD)是影響異基因造血干細胞移植成功最常見的并發(fā)癥，其病理生理機制為植入的供體免疫活性細胞(T淋巴細胞)被宿主(受體)抗

2、原致敏而激活、增殖、分化，直接或間接導致靶器官的損害。aGVHD往往伴有造血功能障礙，影響患者生存。但目前aGVHD導致免疫造血功能障礙的機制尚不清楚。其機制有兩種可能：一是aGVHD過程中產(chǎn)生的細胞因子導致造血功能受抑，另一可能機制為骨髓微環(huán)境(niche)缺陷導致的HSC功能調(diào)控障礙。近年來的研究表明疾病狀態(tài)下骨髓niche對HSC有顯著影響。目前研究認為骨髓niche主要有兩種，即骨內(nèi)膜niche和血管niche，前者主要由位于骨

3、內(nèi)膜的成骨細胞所組成，后者主要由血管竇狀隙內(nèi)皮細胞(sinusoidalendothelialcells；SEC)和血管周圍細胞組成。研究發(fā)現(xiàn)血管niche在維持HSC池穩(wěn)定和調(diào)控HSC自我更新能力等方面發(fā)揮重要作用。allo-HSCT后受體造血細胞來源于供體造血干細胞，而骨髓niche仍為受體來源，因此理論上受體骨髓niche，尤其是血管niche可為急性GVHD的靶器官。由此，我們設想急性GVHD導致骨髓niche尤其是血管nich

4、e功能缺陷，從而影響niche對供體正常HSC的功能調(diào)控，引起HSC生物功能改變和數(shù)量減少。因此研究急性GVHD是否通過導致骨髓血管niche功能缺陷從而引起造血功能障礙和初步闡明其機制，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。
　　 本研究擬解決以下幾個主要問題：1.如何鑒定小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞?建立主要組織相容性復合物(majorhistocompatibilitycomplex；MHC)半相合小鼠骨髓移植aGVHD模型，利用

5、多參數(shù)設門，流式細胞術分選骨髓竇內(nèi)皮細胞，并用細胞化學染色等手段鑒定。2.aGVHD對骨髓竇內(nèi)皮細胞的影響及其機制如何?采用流式細胞術和骨髓組織病理學、RT-PCR方法檢測aGVHD組及對照組(無aGVHD)小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞的數(shù)量、比例、增殖、凋亡及MHC分子表達及T細胞亞群的變化及FasL表達情況。3.aGVHD狀態(tài)下HSCs生物學特性變化與骨髓內(nèi)皮細胞變化的相關性及機制?流式細胞術檢測HSC的數(shù)量和比例；競爭性及連續(xù)性移植模型檢測

6、aGVHD對HSC、骨髓微環(huán)境的影響；流式細胞術檢測骨髓干細胞趨化因子CXCR4及骨髓內(nèi)皮細胞表達SDF-1表達情況(SDF-1/CXCR4軸)；RT-PCR方法檢測HSC中C-Kit及骨髓竇內(nèi)皮細胞SCF的基因表達強度(SCF/C-Kit軸)。
　　 第一部分，小鼠半相合aGVHD移植模型建立和骨髓竇內(nèi)皮細胞免疫表型及鑒定
　　 研究方法:
　　 小鼠半相合aGVHD移植模型的建立：移植受體小鼠：雌性Balb/

7、c(H-2d；表型CD45.2)；供體小鼠：雄性CB6F1(BALB/cH-2d；表型CD45.2×C57BL/6H-2b；表型CD45.1；F1H-2b/d表型CD45.1/2)。隨機分為三組：GVHD組每只受體小鼠移植CB6F1來源的骨髓細胞5×106和髀細胞6×107，正常移植對照組每只小鼠儀移植CB6F1來源的骨髓細胞5×106，空白對照組僅接受輸注同體積的PBS。半相合移植模型受體小鼠移植前接受8Gy同位素銫照射。觀察移植后急

8、性GVHD發(fā)生情況及小鼠生存、檢測外周血。取移植后14、21天GVHD及BMT組小鼠皮膚、肝臟、小腸行常規(guī)石蠟包埋病理切片，HE染色。流式細胞檢測造血細胞CD45.1、CD45.2表達了解植入情況。流式細胞術檢測CD150+/CD48-設門檢測造血干細胞數(shù)量比例
　　 骨髓竇內(nèi)皮細胞免疫表型及鑒定流式細胞術檢測正常小鼠骨髓單個核細胞Sca-1、CD45、VEGFR2、VEGFR3表達；SSClow/VEGFR設門分選細胞行VE-

9、cadherin細胞化學染色，熒光顯微鏡觀察陽性率，以分選CD4-/CD8+T細胞作為細胞化學染色對照。
　　 結果:
　　 成功建立小鼠半相合移植急性移植物抗宿主病模型PBS組移植10天后出現(xiàn)死亡，急性GVHD組小鼠10天后逐漸出現(xiàn)腹瀉、血便、體重減輕、脫毛、弓背等表現(xiàn)，15天后出現(xiàn)死亡，BMT組全部存活。急性GVHD的發(fā)病率為100％；病理切片HE染色提示：可見皮膚、肝臟、小腸組織形態(tài)學改變及其中不同程度炎性細胞浸潤

10、符合GVHD表現(xiàn)；流式細胞檢測提示受鼠造血細胞表型由CD45.2陽性轉變?yōu)镃D45.1/2陽性(單純CD45.2表達低于1％)。外周血和造血干細胞的數(shù)量比例減少提示該模型可出現(xiàn)造血抑制，能夠滿足研究的需要。小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞免疫表型表現(xiàn)為Sea-1-、CD45-、VEGFR2+、VEGFR3+、VE-cadherin+，SSClow/VEGFR3+的竇內(nèi)皮細胞高表達VEGFR2，低表達CD45；流式細胞術SSClow/VEGFR3+設門

11、分選竇內(nèi)皮細胞噴涂于玻片行VE-cadherin細胞化學染色，陽性率95％以上。CD8+T細胞作為對照，熒光顯微鏡下結果陰性。
　　 小結:
　　 以上研究結果表明急性GVHD小鼠模型建立方法可行并適用于對GVHD條件下HSCs功能影響的研究；VEGFR3是骨髓竇內(nèi)皮細胞較為特異的指標，流式細胞術SSClow/VEGFR3設門可以用于進一步研究骨髓竇內(nèi)皮細胞。
　　 第二部分，急性GVHD小鼠骨髓血管niche缺

12、陷對HSC/HPC的影響
　　 研究方法:
　　 二次移植檢測移植后小鼠造血干細胞的增殖分化能力
　　 連續(xù)移植：GVHD和BMT組移植后14天受體小鼠(供鼠為CB6F1：H-2b/d；表型CD45.1/2，受鼠為Balb/C：H-2d；表型CD45.2)處死后，收集脛骨MNC，以細胞數(shù)5×106/只進行二次移植，受體小鼠為Balb/C/小鼠，移植前均經(jīng)8Gy照射；二次移植后14天流式檢測骨髓單個核數(shù)量及粒系(G

13、r-1)、單核(CD11b)、B細胞(B220)陽性細胞的比例。競爭性移植：移植后14天GVHD和BMT組小鼠(供鼠為CB6F1：表型CD45.1/2，受鼠為Balb/C：表型CD45.2)，PBS沖洗獲得下肢骨MNC，以移植后小鼠MNC細胞與正常F1小鼠(CB6F1：表型CD45.2)MNC細胞等量混合，細胞數(shù)5×106/只植入8Gy放療后的Balb/C受鼠，二次移植后14天檢測兩組小鼠CD45.1+/CD45.2+造血細胞中粒系(G

14、r-1)、單核(CD11b)、B細胞(B220)陽性細胞比例。流式細胞術檢測小鼠骨髓中造血干細胞比例：取移植后第14、21天GVHD組及BMT組小鼠，Lin-/CD48-/CD150+標記造血干細胞，檢測干細胞占MNC細胞比例。流式細胞術檢測小鼠骨髓造血干細胞CXCR4及骨髓內(nèi)皮細胞SDF-1的表達(SDF-1/CXCR4軸)：PBS沖洗獲得移植后14天GVHD及BMT組小鼠骨髓MNC，檢測Lin-/CD48-/CD150+標記的造血干

15、細胞檢NCXCR4的表達比例，檢測SSClow/VEGFR3+內(nèi)皮細胞中SDF-1的表達比例，比較兩組差異。RT-PCR方法檢測小鼠骨髓內(nèi)皮細胞SCF及造血干細胞C-kit相關基因的表達(SCF/C-kit軸)：取移植后第14天GVHD及BMT組小鼠各3組，常規(guī)獲取骨髓單個核細胞，VEGFR2+/VEGFR3+/Sca-1-設門分選骨髓竇內(nèi)皮細胞，數(shù)量為5-8×105，Lin-/CD48-/CD150+設門分選造血干細胞，數(shù)量為5-7×

16、105，Trizol吹打裂解后凍存于-40℃冰箱，定制相關引物后檢測。
　　 結果:
　　 二次移植：連續(xù)移植14天后GVHD與BMT組小鼠每個脛骨的MNC及粒系(Gr-1)、單核(CD11b)、B細胞(B220)的比例及絕對值均無差異(P均>0.05)；競爭移植14天后單個脛骨MNC及CD45.1+/CD45.2+絕對值及比例均無差異，競爭移植各系比例及絕對值均無差異(P均>0.05)。
　　 流式細胞術檢測G

17、VHD組移植后第14天造血干細胞比例低于BMT組：GVHD組Lin-/CD48-/CD150+占骨髓MNC細胞比例為(0.6175±0.033)％，BMT組比例為(0.745±0.015)％(N=4P=0.013)。移植后第14天GVHD組與BMT組造血干細胞表達CXCR4比例無差異：兩組Lin-/CD48-/CD150+均高表達CXCR4，GVHD組比例為(96.5±7.65)％，BMT組比例為(94.8±6.42)％(N=4P>0.

18、05)。移植后第14天GVHD組與BMT組骨髓竇內(nèi)皮細胞表達SDF-1比例無差異：GVHD組比例為(93.7±8.53)％，BMT組比例為(87.5±10.61)％(N=4，P>0.05)。RT-PCR方法檢測GVHD組移植后第14天小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞SCF表達低于BMT組：GVHD組相對表達量均數(shù)為：0.0326±0.004(N=3)，BMT組相對表達量均數(shù)為：0.3285±0.079(N=3)。RT-PCR方法檢測GVHD組移植后第

19、14天小鼠骨髓造血干細胞C-Kit表達低于BMT組：GVHD組相對表達量均數(shù)為：0.0205±0.002(N=3)，BMT組相對表達量均數(shù)為：0.0341±0.003(N=3)。
　　 小結:
　　 以上實驗證明：發(fā)生GVHD的小鼠骨髓細胞中造血干細胞比例低于BMT組，但連續(xù)移植及競爭性移植證明來源于GVHD的小鼠的造血干細胞本身增殖分化能力并不低于BMT組，其抑制干細胞的原因來源于骨髓niche，GVHD條件下內(nèi)皮細胞

20、并不通過SDF-1/CXCR4軸影響干細胞的比例，GVHD小鼠骨髓內(nèi)皮細胞SCF表達低于BMT組，受損的骨髓內(nèi)皮破壞了造血干細胞的微環(huán)境，可能通過SCF/C-Kit途徑影響干細胞的增殖。
　　 第三部分;急性GVHD小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞的變化與供者T細胞的關系
　　 研究方法:
　　 流式細胞術檢測小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞數(shù)量、比例、增殖及MHC分子及Fas表達：
　　 PBS反復沖洗小鼠急性GVHD及BMT組移

21、植后第14、21天單個脛骨，收集單個核細胞，光鏡下計數(shù)，裂解紅細胞后行流式細胞檢測小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞比例、數(shù)量：檢測VEGFR2+/VEGFR3+/Sca-1-比例，結合MNC計算竇內(nèi)皮細胞絕對值；SSClow/VEGFR3+/ki-67+細胞比例檢測內(nèi)皮細胞增殖；SSClow/VEGFR3+/AnnexinV+/PI-檢測內(nèi)皮細胞凋亡；SSClow/VEGFR3+/Fas+檢測骨髓竇內(nèi)皮細胞的Fas表達強度；SSClow/VEGFR3

22、+/MHC-Ⅰ、SSClow/VEGFR3+/MHC-Ⅱ檢測內(nèi)皮細胞中MHC分子的表達；T細胞亞群比例、來源及FasL表達：小鼠急性GVHD及BMT組移植后第14、21天脛骨單個核細胞CD8/CD4設門檢測T細胞亞群比例，CD8/CD4設門后檢測FasL的表達強度，檢測CD45.1和CD45.2陽性比例了解T細胞的供受者來源。病理學檢測移植后第7、14、21天GVHD小鼠骨髓增生程度及內(nèi)皮細胞變化：采用常規(guī)HE、免疫組化染色及塑料包埋骨

23、髓切片方法，顯微鏡下觀察。ELISA方法檢測小鼠促內(nèi)皮生長因子濃度：取移植后第7、14、21天GVHD及BMT組小鼠脛骨一根，定容1mlPBS反復沖洗，收集沖洗液，常規(guī)獲取小鼠血清，采用ELISAKit檢測血清及沖洗液中VEGF、SDF-1、bFGF濃度。RT-PCR方法檢測小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞Fas、Caspase-3凋亡相關基因的表達：取移植后第14天GVHD及BMT組小鼠各3組，常規(guī)獲取骨髓單個核細胞，VEGFR2+/VEGFR3+

24、/Sca-1-設門分選骨髓竇內(nèi)皮細胞，數(shù)量為5-8×105，CD8/CD4設門分選CD4+/CD8-及CD4-/CD8+T細胞，數(shù)量為106，Trizol充分吹打，裂解凍存于-40℃，定制相關引物后檢測。
　　 結果:
　　 移植后14天、21天GVHD組小鼠每根脛骨中骨髓MNC計數(shù)均低于BMT組：移植后14天骨髓MNC計數(shù)GVHD和BMT組分別為(1.10±0.21)×107、(1.71±0.32)×107(N=4，P

25、=0.0316)；移植后21天GVHD和BMT組分別為(0.58±0.14)×107、(2.14±0.38)×107(N=4，P=0.0076)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨銹竇內(nèi)皮細胞的比例低于BMT組：移植后14天GVHD和BMT組骨髓竇內(nèi)皮細胞的比例分別為(0.145±0.132)％、(0.335±0.070)％(N=4，P=0.0253)：移植后21天GVHD和BMT組分別為(0.028±0.019)％、(0.552±0.

26、124)％(N=4，P=0.0017)。移植后14天、21天GVHD小鼠每根脛骨中骨髓竇內(nèi)皮細胞的絕對數(shù)均低于BMT組：移植后第14天GVHD和BMT組骨髓竇內(nèi)皮細胞的絕對值計數(shù)分別為(1.595±0.41)×104、(5.695±0.78)×104(N=4，P=0.0037)；移植后21天GVHD和BMT組計數(shù)分別為及(0.3234±0.11)×104、(11.55±2.38)×104(N=4，P=0.0001)。移植后14天GVHD

27、小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞表達Ki-67的比例與BMT組比較無差異：移植后14天GVHD組和BMT組VEGFR3+/Ki-67+比例分別為(0.125±0.053)％、(0.275±0.058)％(N=4，P=0.053)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞凋亡比例增高：移植后14天GVHD組和BMT組SSClow/VEGFR3+內(nèi)皮細胞中AnnexinV+/PI-比例分別為(39.57±2.77)％、(28.37±1.97)％(N

28、=4，P=0.016)；移植后21天GVHD組和BMT組分別為(29.87±2.55)％、(18.47±1.72)％(N=4，P=0.010)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞表達MHC-Ⅰ類分子的比例與BMT組比較無差異：移植后14天GVHD組和BMT組SSClow/EGFR3+內(nèi)皮細胞陽性表達MHC-Ⅰ比例分別為(81.62±3.64)％、(78.35±3.64)％(N=4，P=0.470)；移植后21天GVHD組和B

29、MT組比例分別為(70.10±3.19)％、(64.27±5.13)％(N=4，P=0.372)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞表達MHC-Ⅱ類分子的比例高于BMT組：移植后14天GVHD組和BMT組SSClow/VEGFR3+內(nèi)皮細胞陽性表達MHC-Ⅱ比例分別為(57.32±3.61)％、(21.25±3.09)％(N=4，P=0.00035)；移植后21天GVHD組和BMT組分別為(15.60±1.25)％、(9.9

30、5±2.68)％(N=4，P=0.033)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓竇內(nèi)皮細胞陽性表達Fas的比例高于BMT組：移植后14天GVHD組和BMT組SSClow/VEGFR3+內(nèi)皮細胞陽性表達Fas比例分別為(87.6±3.48)％、(63.92±3.76)％(N=4，P=0.0036)；移植后21天GVHD組和BMT組分別為(72.5±3.33)％、(26.55±7.17)％(N=4，P=0.0011)。移植后14天、21天G

31、VHD小鼠骨髓CD4+T細胞陽性表達FasL的比例均高于BMT組：移植后14天GVHD組和BMT組骨髓CD4+/CD8-T細胞表達FasL比例分別為(72.8±6.24)％、(45.72±2.53)％(N=4，P=0.007)；移植后21天GVHD組和BMT組分別為(72.2±4.31)％、(31.35±7.84)％(N=4，P=0.0004)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓CD8+T細胞陽性表達FasL的比例均高于BMT組：移植

32、后14天GVHD組和BMT組骨髓CD4-/CD8+T細胞表達Fas比例分別為(56.32±3.99)％、(15.95±3.27)％(N=4，P=0.002)；移植后21天GVHD組和BMT組分別為(22.31±4.75)％、(9.82±1.11)％(N=4，P=0.043)。移植后14天GVHD及BMT小鼠骨髓CD4+T細胞來源于供者：CD8/CD4設門后檢測CD4+T中CD45.1+/CD45.2+比例分別為(97.96±0.76)％

33、、(96.57±1.10)％。
　　 病理學檢測移植后GVHD小鼠骨髓增生程度及竇內(nèi)皮細胞變化：
　　 HE、免疫組化染色及塑料包埋切片光鏡下均可以從形態(tài)辨識骨髓竇內(nèi)皮細胞，特點為沿血竇周圍分布，細胞狹長，細胞核呈梭形。免疫組化VEGFR3染色竇內(nèi)皮細胞胞漿呈棕色，核深染，呈梭形。塑料包埋切片從原始到成熟各階段細胞的細胞質由藍色至紅色過度層次明顯，血竇及內(nèi)皮細胞形態(tài)清晰。
　　 正常小鼠骨髓有核細胞增生活躍，扁平

34、樣血竇多見，無成熟紅細胞外溢至血竇外。
　　 移植后第14天PBS組小鼠骨髓增生明顯受抑制，有核細胞少見，空泡為主，幾乎未見血竇及內(nèi)皮細胞。
　　 移植后第14天GVHD組骨髓增生受抑制，有核細胞明顯減少，空泡多見，血竇數(shù)量明顯減少，血竇腫脹，閉合破壞，可見成熟紅細胞逸出至血竇外。第21天有核細胞進一步減少，內(nèi)皮細胞偶見，血竇結構難以辨識。
　　 移植后第14天BMT組增生較活躍，有核細胞多見，血竇破壞較GVHD

35、組減輕，可見成熟紅細胞逸出至血竇外。第21天有核細胞增生活躍，血竇形態(tài)恢復，結構完整，無紅細胞逸出。
　　 ELISAKit檢測GVHD組及BMT組血清及骨髓沖洗液上清中VEGF、SDF-1、bFGF濃度：
　　 沖洗液上清VEGF濃度兩組間無統(tǒng)計學差異：移植后第7天GVHD和BMT組分別為(32.84±8.76)ng/ml、(51.08±13.18)ng/ml；移植后第14天分別為(55.64±9.23)ng/ml、(

36、125.70±22.09)ng/ml；移植后第21天分別為(22.19±5.41)ng/ml、(50.17±13.47)ng/ml(n=3，P均>0.05)。移植后7、14天血清VEGF濃度GVHD組低于BMT組，移植后第21天VEGF濃度兩組間無統(tǒng)計學差異：移植后第7天GVHD和BMT組分別為(125.18±4.68)ng/ml、(153.52±5.17)ng/ml(n=3，P=0.015)；移植后第14天分別為(149.16±4.7

37、1)ng/ml、(229.92±3.84)ng/ml(n=3，P=0.025)；移植后第21天分別為(179.62±45.23)ng/ml、(162.55±21.74)ng/ml(n=3，P=0.732)。沖洗液上清SDF-1濃度兩組間均無統(tǒng)計學差異：移植后第7天GVHD和BMT組分別為(164.52±32.14)ng/ml、(178.88±23.56)ng/ml；移植后第14天分別為(156.85±32.68)ng/ml、(196.3

38、8.±30.65)ng/ml；移植后第21天分別為(139.80±26.47)ng/ml、(154.33.±45.58)ng/ml(n=3，P均>0.05)。血清SDF-1濃度兩組間均無統(tǒng)計學差異：移植后第7天GVHD和BMT組分別為(113.78±30.13)ng/ml、(217.65±76.18)ng/ml；移植后第14天分別為(395.46±236.30)ng/ml、(563.67±146.25)ng/ml；移植后第21天分別為(

39、278.80±97.90)ng/ml、(486.16±22.78)ng/ml(n=3，P均>0.05。沖洗液上清bFGF濃度兩組間均無統(tǒng)計學差異：移植后第7天GVHD和BMT組分別為(181.825±47.70)ng/ml、(234.325±44.37)ng/ml；移植后第14天分別為(168.90±39.21)ng/ml、(148.70±30.01)ng/ml；移植后第21天分別為(104.07±16.77)ng/ml、(127.62

40、±32.15)ng/ml(N=3，P均>0.05)。血清bFGF濃度兩組間均無統(tǒng)計學差異：移植后第7天GVHD和BMT組分別為(119.57±13.49)ng/ml、(110.85±17.44)ng/ml；移植后第14天分別為(83.58±14.04)ng/ml、(211.03±40.08)ng/ml；移植后第21天分別為(222.34±73.07)ng/ml、(111.44±17.93)ng/ml(n=3，P均>0.05)。
　

41、　 RT-PCR方法檢測GVHD組移植后第14天小鼠骨髓內(nèi)皮細胞Fas，Caspase-3表達高于BMT組：GVHD組Fas相對表達量均數(shù)為：0.2536±0.021(N=3)，BMT組相對表達量均數(shù)為：0.0852±0.013(N=3)。GVHD組Caspase-3相對表達量均數(shù)為：0.2910±0.086(N=3)，BMT組相對表達量均數(shù)為：0.0323±0.012(N=3)。
　　 小結:
　　 以上實驗證實半相