神經(jīng)浸出液誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向雪旺細(xì)胞分化的研究與應(yīng)用.pdf

1、周?chē)窠?jīng)損傷在臨床中比較常見(jiàn)，由于成熟的神經(jīng)元不能分裂增殖，因此，外周神經(jīng)損傷后的修復(fù)效果很不理想。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，人們用組織工程神經(jīng)代替自體神經(jīng)修復(fù)外周神經(jīng)損傷并取得了較好效果。組織工程神經(jīng)的構(gòu)建主要包含種子細(xì)胞、支架材料和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子三個(gè)方面，其中理想的種子細(xì)胞是構(gòu)建人工神經(jīng)的前提和基礎(chǔ)。雪旺細(xì)胞（Schwann cells，SCs）在神經(jīng)再生中起重要作用，是修復(fù)神經(jīng)損傷理想的種子細(xì)胞。但是 SCs體外培養(yǎng)困難，增殖速度慢，且

2、培養(yǎng)過(guò)程中容易受到成纖維細(xì)胞污染，不能滿足神經(jīng)修復(fù)的要求。脂肪源性干細(xì)胞（Adipose stem cells，ADSCs）是具備多向分化潛能的干細(xì)胞，在特定環(huán)境下可以向 SCs分化，同時(shí)，ADSCs還具有來(lái)源廣泛、取材簡(jiǎn)便、并發(fā)癥少、增殖速度快、擴(kuò)增穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，因此可以成為組織工程神經(jīng)理想的種子細(xì)胞來(lái)源。然而目前常用的誘導(dǎo) ADSCs向 SCs分化的方法都存在一定的弊端。本研究應(yīng)用共培養(yǎng)原理，利用外周神經(jīng)分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來(lái)誘導(dǎo) AD

3、SCs向SCs分化，以期簡(jiǎn)化操作程序，節(jié)約誘導(dǎo)成本，為解決臨床上修復(fù)外周神經(jīng)損傷過(guò)程中的種子細(xì)胞難題提供新思路，整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為五個(gè)部分。
　　1.大鼠ADSCs的體外分離培養(yǎng)和鑒定
　　無(wú)菌條件下取出3周齡SD大鼠兩側(cè)腹股溝脂肪，采用Ⅰ型膠原酶消化法獲得單細(xì)胞懸液，并培養(yǎng)在含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中。通過(guò)骨向和脂向分化以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面Marker對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)后ADSCs形成典型的黑色

4、鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈現(xiàn)紅色；成脂誘導(dǎo)后逐漸出現(xiàn)脂滴，油紅O染色為紅色。流式檢測(cè)結(jié)果顯示：CD44和CD90呈陽(yáng)性表達(dá)，CD31和CD45呈陰性。以上結(jié)果證實(shí)，分離到的細(xì)胞為ADSCs。
　　2. ADSCs體外特性研究
　　本部分的目的是掌握 ADSCs的體外分化特性，為選擇合適的傳代次數(shù)和適宜的接種密度提供理論基礎(chǔ)。將 ADSCs培養(yǎng)至12代，然后誘導(dǎo)第3、6、9和12代的 ADSCs向成骨和成脂分化，并通過(guò)茜素紅和油紅

5、O染色對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)選取第3代 ADSCs用兩種不同的密度（5×105/cm2和1×103/cm2）進(jìn)行接種，再用 Western-blot檢測(cè)第3、6、9、12代以及兩種不同傳代密度的ADSCs的 BMP-2的表達(dá)，并檢測(cè)第1-12代 ADSCs的堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性。結(jié)果證實(shí)，第3、6、9、12代的ADSCs均可被誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，但隨著傳代次數(shù)的增加， ADSCs成脂分

6、化潛能逐漸降低，成骨能力未見(jiàn)明顯差異。第12代以及以1×103/cm2密度培養(yǎng)的 ADSCs的BMP-2呈陽(yáng)性表達(dá)；隨著傳代次數(shù)的增加，第1-12代的ADSCs ALP活性逐步增加，1×103/cm2密度培養(yǎng)的 ADSCs的 ALP活性較5×105/cm2接種的 ALP活性顯著增加。ADSCs在體外連續(xù)傳代或者以較低密度接種時(shí)可導(dǎo)致衰老并自發(fā)分化成骨。因此 ADSCs的體外研究應(yīng)選擇3-5代，并以5×105/cm2的密度進(jìn)行傳代較為適宜

7、。
　　3.神經(jīng)浸出液的制備及對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)樣分化的影響
　　無(wú)菌采集的大鼠坐骨神經(jīng)通過(guò)剪碎、浸泡、過(guò)濾制備出神經(jīng)浸出液，待用。為了初步驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室制備的神經(jīng)浸出液具有促進(jìn)前體細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的潛能，本研究選擇 PC12細(xì)胞作為前體細(xì)胞模型，將制備好的神經(jīng)浸出液代替PC12細(xì)胞的培養(yǎng)基，觀察 PC12細(xì)胞軸突分化情況。對(duì)神經(jīng)浸出液培養(yǎng)第3、6、9 d的PC12細(xì)胞軸突長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)，并檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)志物β3-tubu

8、lin和MAP-2的表達(dá)。結(jié)果顯示，神經(jīng)浸出液培養(yǎng)的 PC12細(xì)胞明顯長(zhǎng)出突起，第3、6、9 d的軸突平均長(zhǎng)度分別達(dá)到28.07±1.76μm、58.14±2.60μm、170.43±10.08μm；神經(jīng)元標(biāo)志物β3-tubulin和 MAP-2蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，初步證實(shí)神經(jīng)浸出液具有誘導(dǎo)前體細(xì)胞神經(jīng)樣分化的潛能。
　　4.神經(jīng)浸出液誘導(dǎo)ADSCs向SCs分化
　　取培養(yǎng)至第3代的 ADSCs，用神經(jīng)浸出液代替正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)

9、5 d后用免疫熒光和 Western-blot檢測(cè) SCs特異標(biāo)志蛋白 S-100和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表達(dá)，以證實(shí)誘導(dǎo)效果。結(jié)果表明神經(jīng)浸出液誘導(dǎo)后的 ADSCs形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體由寬大扁平樣轉(zhuǎn)變?yōu)閮蓸O或多極，部分胞體變小，呈梭形，出現(xiàn)2~3個(gè)長(zhǎng)突起，類(lèi)似成熟的SCs。免疫熒光和Western-blot檢測(cè)結(jié)果均顯示SCs標(biāo)志物S-100和GFAP呈陽(yáng)性表

10、達(dá)，表明神經(jīng)浸出液能夠誘導(dǎo)ADSCs向SCs分化。
　　5.神經(jīng)浸出液誘導(dǎo)的ADSCs對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的修復(fù)作用
　　將 ADSCs與膠原凝膠復(fù)合并注入支架材料中制備成組織工程神經(jīng)移植物作為A組，復(fù)合誘導(dǎo)后的ADSCs制備成組織工程神經(jīng)移植物為B組，植入大鼠1 cm坐骨神經(jīng)損傷處，并用未復(fù)合細(xì)胞的支架材料組（C組）和自體神經(jīng)移植組（D組）作為對(duì)照。修復(fù)大鼠神經(jīng)損傷，2個(gè)月后通過(guò)電鏡觀察、電生理以及圖像分析等方法進(jìn)行神經(jīng)再生