SHIP基因在白血病發(fā)病機(jī)制中作用的研究.pdf

1、背景：白血病是原發(fā)于造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。近年來(lái)，其發(fā)病率呈增加趨勢(shì)。在35歲以下人群中，白血病的死亡率占惡性腫瘤第一位，嚴(yán)重危害中青年人的生命，所以值得特別重視。急性白血病的發(fā)生包括了復(fù)雜的基因突變、缺失、癌基因激活及抑癌基因失活等多種分子生物學(xué)水平的異常。盡管許多基因在白血病發(fā)病中的作用及其機(jī)制已初步明確，但所有的基因異常仍不能解釋全部白血病的發(fā)生機(jī)制，因此，尋找新的白血病相關(guān)基因并研究其生物學(xué)功能一直是白血病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，不僅

2、有助于闡明白血病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，而且可能找到一些治療靶位點(diǎn)。
　　 SHIP基因是繼PTEN之后發(fā)現(xiàn)的僅在造血細(xì)胞表達(dá)的一種新的肌醇磷酸酶，其主要功能是降解PIP3成為PI3，4P2而負(fù)調(diào)控PI3K/Akt路徑。本課題組多年來(lái)一直圍繞SHIP基因功能與白血病發(fā)生發(fā)展關(guān)系開(kāi)展研究工作，取得了一系列有意義的研究成果。首次報(bào)道急性白血病患者存在SHIP基因突變，并證實(shí)SHIP基因低表達(dá)和表達(dá)缺失與人白血病細(xì)胞惡性增殖密切相關(guān)，通過(guò)干擾

3、RNA封閉K562細(xì)胞的bcr/abl融合基因使SHIP蛋白重新表達(dá)并可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的異常增殖表型，近年來(lái)也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了一些白血病細(xì)胞中新的SHIP基因突變。這些都提示SHIP基因具有調(diào)控白血病細(xì)胞增殖、凋亡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但是，有關(guān)SHIP基因調(diào)控白血病細(xì)胞系K562的PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的分子機(jī)理及其在抑制和/或逆轉(zhuǎn)K562細(xì)胞增殖能力中的地位，以及SHIP基因突變對(duì)P13K/Akt的調(diào)控有何改變等問(wèn)題，目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)報(bào)道。本

4、研究的目的是：（1）探討野生型SHIP基因?qū)θ税籽〖?xì)胞系K562中PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響；（2）構(gòu)建攜帶突變型SHIP基因的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞系；（3）探討SHIP基因突變后在K562細(xì)胞中的功能變化，為進(jìn)一步研究SHIP基因在白血病發(fā)病機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分野生型SHIP基因?qū)Π籽〖?xì)胞系K562增殖凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:探討肌醇5，磷酸酶基因SHIP對(duì)人白

5、血病細(xì)胞系K562增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 方法:將攜帶有野生型SHIP基因和空載體的慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人白血病細(xì)胞系K562。MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞周期分布；顯微鏡及透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)改變，TUNEL、Hoechst33342熒光染色、細(xì)胞集落形成等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后SHIP mR

6、NA表達(dá)變化，Western Blot檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組SHIP、Akt、p-Akt308、p-Akt473、Bcl-2、Bax、Bad、Bcl-xL、CyclinD1、p27kip1、p21WAF1、NFκB蛋白水平變化。Caspase活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9活性。NFκB活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NFκB活性變化。
　　 結(jié)論:過(guò)表達(dá)野生型SHIP基因明顯抑制白血病細(xì)胞系K562增殖，促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡，

7、其機(jī)制可能通過(guò)抑制Akt磷酸化，進(jìn)一步影響其下游與多種凋亡相關(guān)分子家族蛋白如Bcl-2家族、Caspase家族表達(dá)，并通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。
　　 第二部分 SHIP基因突變體的構(gòu)建
　　 目的:急性白血病患者存在SHIP基因突變，可能與白血病發(fā)病有關(guān)，構(gòu)建SHIP基因突變體（muSHIPP28L），為研究突變基因的表達(dá)和功能與白血病的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:以重組表達(dá)

8、質(zhì)粒wtSHIP為模板，用Stratagen Mutant Kit試劑盒通過(guò)PCR定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)SHIP編碼序列TTC進(jìn)行定點(diǎn)突變→CTC，突變體經(jīng)測(cè)序鑒定正確，連接到慢病毒載體Receiver-Lv31（ORF不帶標(biāo)簽）。經(jīng)重組慢病毒包裝，病毒滴度測(cè)定，感染K562細(xì)胞，采用FO-PCR和Western blot方法檢測(cè)SHIP mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:運(yùn)用基因定點(diǎn)突變基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了SHIP基因P28L突變體

9、，為進(jìn)一步探討SHIP基因與白血病發(fā)病機(jī)制創(chuàng)造條件。
　　 第三部分 SHIP基因突變體在白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞中的表達(dá)及其功能的研究
　　 目的:將構(gòu)建的SHIP基因突變體穩(wěn)定表達(dá)于人白血病細(xì)胞系K562中，觀察SHIP基因突變后在K562細(xì)胞中的功能變化，為進(jìn)一步研究SHIP基因在白血病發(fā)病機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:FQ-PCR和Western blot鑒定野生型和突變型SHIP基因在K562

10、細(xì)胞中的表達(dá)；MTT比較K562/wtSHIP和K562/muSHIP兩組細(xì)胞生長(zhǎng)情況；流式細(xì)胞分析比較野生型和突變型SHIP基因?qū)?xì)胞周期的不同影響；Hoechst33342熒光染色比較細(xì)胞凋亡情況。Western Blot比較轉(zhuǎn)染野生型和突變型SHIP基因后對(duì)K562細(xì)胞Akt、p-Akt308、p-Akt473、Bcl-2、Bax、Bad、Bcl-xL、CyclinDl、p27kip1、p21WAF1、NFκB蛋白表達(dá)的調(diào)控。Ca

11、spase活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組Caspase-3、Caspase-9活性。利用高壓液相色譜分析比較各轉(zhuǎn)染組PIP3和PI3，4P2水平。
　　 結(jié)論:
　　 1.SHIP基因突變體SHIPP28L導(dǎo)致其增殖抑制及促凋亡功能喪失。
　　 2.與野生型SHIP基因相比，SHIPP28L突變體導(dǎo)致其對(duì)K562細(xì)胞caspase-3、caspase-9和NF-κB活性的調(diào)節(jié)作用丟失。
　　 3.SHIP基因調(diào)控