長鏈非編碼RNA-LOCCS對人結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、背景：
　　課題組在前期實(shí)驗(yàn)中比較了結(jié)腸癌細(xì)胞株(SW1116)和結(jié)腸癌干細(xì)胞株(SW1116csc) miRNA表達(dá)譜的差異，其中miR-93的表達(dá)具有顯著差異，miR-93能抑制SW1116csc細(xì)胞增殖和集落形成，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-93的過度表達(dá)抑制HDAC8和TLE4在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。為探索miR-93的上游調(diào)節(jié)分子及其作用機(jī)制，我們在SW1116csc細(xì)胞內(nèi)篩選出一條含有miR-93互補(bǔ)序列的lncRNA

2、，作為下一步實(shí)驗(yàn)的研究對象，并將其命名為LOCCS(lncRNA overexpressed in colon cancer stemcells)。
　　材料與方法：
　　結(jié)腸癌干細(xì)胞株(SW1116csc)是課題組前期從結(jié)腸癌細(xì)胞株(SW1116)中分離而來并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。我們首先根據(jù)LOCCS的序列設(shè)計(jì)并合成siRNA，構(gòu)建和轉(zhuǎn)導(dǎo)pENTR/U6-siLOCCS質(zhì)粒，定量PCR法檢測pENTR/U6-siLOCCS轉(zhuǎn)導(dǎo)S

3、W1116csc細(xì)胞后miR-93表達(dá)水平的改變;其次合成miR-93序列，構(gòu)建和轉(zhuǎn)導(dǎo)pGL3M-miR-93熒光素酶報告載體，應(yīng)用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測內(nèi)源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93的抑制作用;然后采用全基因合成方法合成LOCCS序列，構(gòu)建和轉(zhuǎn)導(dǎo)pcDNA-LOCCS質(zhì)粒，同時使用點(diǎn)突變試劑盒構(gòu)建pcDNA-LOCCS-T質(zhì)粒后進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，應(yīng)用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測外源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93的

4、抑制作用;最后，在上調(diào)或下調(diào)LOCCS的過程中，采用定量PCR法和Western blot法檢測HDAC8、TLE4、CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1表達(dá)水平的變化，同時檢測SW1116csc細(xì)胞生長曲線和集落形成率的改變。
　　結(jié)果：
　　pENTR/U6-siLOCCS質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定能成功表達(dá)siRNA，定量PCR法檢測pENTR/U6-siLOCCS轉(zhuǎn)導(dǎo)后的SW1116csc細(xì)胞，其miR-

5、93表達(dá)水平明顯升高。pGL3M-miR-93質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定能成功表達(dá)miR-93，應(yīng)用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93具有明顯抑制作用。pcDNA-LOCCS質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定能成功表達(dá)LOCCS并且含miR-93互補(bǔ)序列，同時pcDNA-LOCCS-T質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定發(fā)現(xiàn)與miR-93互補(bǔ)序列上的堿基有明顯改變，應(yīng)用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)外源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93具有

6、明顯抑制作用。在mRNA水平上，HDAC8和TLE4在LOCCS-ox組的表達(dá)水平較control組明顯升高，而在LOCCS-si組的表達(dá)水平較control組明顯降低;CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1在LOCCS-ox組和LOCCS-si組的表達(dá)水平較control組明顯降低，而在LOCCS-ox組的降低更為明顯。但是，HDAC8、TLE4、CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1在蛋白

7、質(zhì)水平的表達(dá)與在mRNA水平的表達(dá)不完全一致。同時，我們觀察到細(xì)胞內(nèi)的LOCCS水平與細(xì)胞增殖和集落形成率呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LOCCS在SW1116csc細(xì)胞內(nèi)具有“miRNA海綿”作用，能夠吸附miR-93，降低miR-93的表達(dá)水平，在miR-93的上游對其起到調(diào)控作用。LOCCS促進(jìn)細(xì)胞增殖和集落形成，與miR-93的作用正好相反。LOCCS對HDAC8和TLE4的影響在mRNA水平與miR-93相