長(zhǎng)鏈非編碼RNA NORAD在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、結(jié)腸癌是一種常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，目前臨床上仍采用手術(shù)為主、放化療為輔的治療方法來盡可能多地殺死腫瘤細(xì)胞，減少腫瘤細(xì)胞數(shù)量來達(dá)到治療效果。然而高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率及高耐藥率使結(jié)腸癌術(shù)后5年生存率依然很低，這就使結(jié)腸癌早期診斷、早期治療的研究顯得尤其重要。因此在分子水平上對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和理論價(jià)值。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一種長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非

2、編碼RNA。在人體內(nèi)，lncRNA在基因內(nèi)的分布非常廣泛，雖然lncRNA并不編碼蛋白質(zhì)，但是其參與構(gòu)成復(fù)雜且非常重要的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而巧妙地調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近來研究結(jié)果顯示lncRNAs在正常組織發(fā)育以及調(diào)控細(xì)胞多能性和細(xì)胞分化的過程中起重要作用。此外，lncRNAs參與控制多種分子途徑，引起基因表達(dá)改變，最終調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡與細(xì)胞遷移。因此lncRNAs的表達(dá)失調(diào)與人類多種疾病密切相關(guān)，比如腫瘤形成。
　　但近年的研究表

3、明，lncRNA在表觀遺傳學(xué)水平及轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控癌基因和抑癌基因的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)過程，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是腫瘤診治及預(yù)后判斷的潛在靶標(biāo)。
　　lncRNA NORAD又名LINC00657，定位于Chromosome20:36，045，622-36，050，960，長(zhǎng)度為5339bp，包括一個(gè)外顯子。目前關(guān)于NORAD的報(bào)道非常少，僅有相關(guān)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫提示NORAD在部分腫瘤中表達(dá)異常，提示lncRN

4、ANORAD在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中可能扮演了重要角色。我們的研究第一次綜合分析了lncRNANORAD在結(jié)腸癌中表達(dá)和生物學(xué)作用，并初步探討了其對(duì)腫瘤調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。
　　本研究包括三部分:
　　第一部分:
　　目的:
　　結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA異常表達(dá)及與臨床病理相關(guān)性分析
　　方法:
　　1.運(yùn)用lncRNA基因芯片檢測(cè)6例結(jié)腸癌組織及配對(duì)癌旁正常組織標(biāo)本中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況。
　　2

5、.運(yùn)用RT-qPCR檢測(cè)50例標(biāo)本中4種lncRNA(NORAD，linc01154，nc-KRT7-2和lnc-ITGA5-1)表達(dá)水平，從組織水平驗(yàn)證lncRNA芯片結(jié)果的可靠性。
　　3.運(yùn)用RT-qPCR檢測(cè)3株結(jié)腸癌細(xì)胞株（THC-8307、HT-29、HCT116）及正常人腸上皮細(xì)胞系FHC中l(wèi)ncRNA NORAD的表達(dá)水平，從細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA芯片結(jié)果的可靠性。
　　4.依據(jù)lncRNA的表達(dá)水平

6、，運(yùn)用雙變量相關(guān)性分析lncRNA NORAD與結(jié)腸癌病人性別、年齡、病理類型、分化程度、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.結(jié)腸癌組織中篩選得到35個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中在結(jié)腸癌組織中上調(diào)的lncRNA有20個(gè)(57.14％)和表達(dá)下調(diào)的lncRNA有15個(gè)(42.86％)。
　　lncRNA NORAD在結(jié)腸癌組織中表達(dá)顯著增高。
　　2.50例結(jié)腸癌組織及配對(duì)

7、癌旁正常組織qRT-PCR結(jié)果顯示，lncRNANORAD，linc01154，nc-KRT7-2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(p＜0.05);lnc-ITGA5-1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)顯著低于癌旁正常組織(p＜0.05)，表明用lncRNA檢測(cè)芯片和RT-qPCR兩種方法得到的結(jié)果具有很好的一致性，證實(shí)了芯片數(shù)據(jù)的可靠性。
　　3.lncRNA NORAD在結(jié)腸癌細(xì)胞THC-8307、HT-29、HCT116的表達(dá)顯著高

8、于正常人腸上皮細(xì)胞系(p＜0.05)，進(jìn)一步驗(yàn)證了NORAD結(jié)腸癌表達(dá)水平顯著增加。
　　4.雙變量相關(guān)性分析結(jié)果顯示IncRNA NORAD表達(dá)水平與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移顯著性相關(guān)(p＜0.05)，與病人年齡、性別、病理類型以及腫瘤TNM分期無顯著相關(guān)性(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　結(jié)腸癌組織中篩選得到35個(gè)差異表達(dá)的lncRNA，其中在結(jié)腸癌組織中上調(diào)的lncRNA有20個(gè)(57.14％)，下

9、調(diào)的lncRNA有15個(gè)(42.86％)。lncRNA NORAD和ETS1在結(jié)腸癌組織中異常高表達(dá)，二者表達(dá)存在正相關(guān)，且組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移顯著性相關(guān)顯著性相關(guān)。
　　第二部分:
　　目的:
　　調(diào)控lncRNA NORAD表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖、遷移及侵襲的影響
　　方法:
　　1.制備下調(diào)lncRNA NORAD表達(dá)的重組慢病毒載體，感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，得到沉默ln

10、cRNA NORAD表達(dá)的HT-29細(xì)胞株。
　　2.CCK-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默lncRNA NORAD對(duì)HT-29細(xì)胞增殖能力的影響。
　　3.粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默lncRNA NORAD對(duì)HT-29細(xì)胞粘附能力的影響。
　　4.劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默lncRNA NORAD對(duì)HT-29細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建pLVTHM-lncRNA NORAD載

11、體，測(cè)序及BLAST結(jié)果顯示完全吻合;RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染lncRNA NORAD1組和lncRNA NORAD2組HT-29細(xì)胞的lncRNA NORAD表達(dá)水平顯著下調(diào)(p＜0.05)，得到沉默lncRNA NORAD表達(dá)的HT-29細(xì)胞株。
　　2.CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)，SRC組細(xì)胞增殖能力無顯著變化(p＞0.05)，NORAD1組和NORAD2組HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)在轉(zhuǎn)染后

12、12h后出現(xiàn)抑制(P＜0.05)，并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而日益顯著。
　　3.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組(56.5±10.7)相比，SRC組克隆數(shù)(52.4±7.4)無顯著差異(p＞0.05)，NORAD1組(20.1±3.9)和NORAD2組(23.3±7.3)的克隆數(shù)顯著下降(p＜0.05)，表明沉默lncRNAN ORAD，HT-29細(xì)胞克隆形成能力受到顯著抑制。
　　4.粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各組細(xì)胞鋪板90min后，

13、與對(duì)照組(45.13±6.77)粘附率相比，SRC組粘附率(44.13±5.69)無顯著差異(p＞0，05)，NORAD1組(25.12±4.48)和NORAD2組(25.01±6.72)粘附率顯著下降(p＜0.05)，表明沉默lncRNA NORAD，HT-29細(xì)胞粘附能力受到顯著抑制。
　　5.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，SRC組遷移細(xì)胞數(shù)無顯著差異(p＞0.05)，NORAD1組和NORAD2組遷移細(xì)胞數(shù)顯著下降(p＜0

14、.05)，表明沉默lncRNA NORAD，HT-29細(xì)胞遷移能力受到顯著抑制。
　　6.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對(duì)照組(56.5±10.7)相比，SRC組跨膜細(xì)胞數(shù)(52.4±7.4)無顯著差異(p＞0.05)，NORAD1組(20.1±3.9)和NORAD2組(23.3±7.3)的跨膜細(xì)胞數(shù)顯著下降(p＜0.05)，表明沉默lncRNA NORAD，HT-29細(xì)胞侵襲受到顯著抑制。
　　結(jié)論:
　　下

15、調(diào)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NORAD表達(dá)有效抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。
　　第三部分:
　　目的:
　　lncRNA NORAD作用機(jī)制的初步研究
　　方法:
　　1.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與NORAD相互作用的靶基因
　　2.利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌組織標(biāo)本中ETS-1的表達(dá)，并對(duì)其與臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　3.利用下調(diào)ets-1慢病毒載體轉(zhuǎn)染HT-2

16、9細(xì)胞，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwe11侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)ETS1對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。
　　4.利用Western-blot檢測(cè)下調(diào)NORAD結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中uPA、MMP9表達(dá)的影響
　　5.利用Western-blot檢測(cè)下調(diào)Ets-1結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中uPA、MMP9表達(dá)的影響
　　結(jié)果:
　　1.對(duì)比癌旁正常組織，結(jié)腸癌組織中ETS

17、1表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示結(jié)腸癌組織中ETS1的表達(dá)水平與結(jié)腸癌組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移顯著性相關(guān)，與病人年齡、性別及病理類型無相關(guān)性(P＜0.05)。結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA NORAD和ETS-1表達(dá)存在正相關(guān)(R2=0.512)，二者都顯示出異常高表達(dá)的特征。
　　2.下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29中ETS-1表達(dá)抑制了細(xì)胞生長(zhǎng);對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29克隆形成能力、粘附能力、遷移能力及侵