長非編碼RNA在人脂肪干細胞向分化的差異表達分析.pdf

1、目的：肥胖癥患病率增多引起了人們對脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)分化為脂肪細胞之機制的強烈興趣。實驗表明長非編碼RNA(lncRNAs)參與調(diào)控小鼠胚胎干細胞的全能性及成脂分化。本實驗通過人ADSCs成脂誘導(dǎo)分化，獲得lncRNAs差異表達譜，預(yù)測其作用的靶基因，初步建立其相關(guān)調(diào)控基因、細胞因子網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出可能發(fā)揮作用的lncRNAs。試圖找出lncRNAs在成脂分化中的機制及調(diào)控通路，

2、為肥胖的基礎(chǔ)治療提供依據(jù)。
　　 方法：組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)3例人ADSCs，對第三代細胞流式細胞儀鑒定;每例細胞分成三組(0d、5d和12d)，在成脂誘導(dǎo)5d、12d進行油紅O染色鑒定脂滴;對剩余樣本進行總RNA抽提及質(zhì)檢，標記后微陣列雜交、芯片掃描，獲得ADSCs成脂分化0d、5d、12d lncRNAs的差異表達譜;對數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，挑選Induce5d vs0d，Induce12d vs0d，Induce12d vs

3、5d三組差異表達分子，進行相關(guān)性分析、樣本層次聚類及熱圖繪制;繪制信號通路及分子網(wǎng)絡(luò)圖;篩選出與脂類代謝相關(guān)的差異表達的lncRNAs;對其及其可能的靶基因進行qRT-PCR驗證;統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果：第三代人ADSCs表面抗原:CD29、CD44、CD90、CD105表達陽性，CD34、CD45、CD106表達陰性;ADSCs成脂誘導(dǎo)5d、12d油紅O染色，其脂滴計數(shù)分別是5％和78％;總RNA質(zhì)檢:所有樣本A260/A28

4、0值均在1.80～2.10;芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析獲得三組差異表達分子:Induce5d vs0d:172 mRNA和209 lncRNA; Induce12d vs0d:184 mRNA和158lncRNA; Induce12d vs5d:147 mRNA和196 lncRNA;結(jié)合網(wǎng)絡(luò)圖獲得與脂類代謝相關(guān)的28個lncRNAs，篩選出差異表達的3個lncRNAs即AK304548、BP216319、DA852857，對其及預(yù)測的靶

5、基因ARHGEF2、FABP3、CALD1進行qRT-PCR驗證，AK304548、BP216319、ARHGEF2及FABP3呈現(xiàn)與芯片相符的先下調(diào)后上調(diào)的變化趨勢，其差異表達有統(tǒng)計學(xué)意義(配對t檢驗，P＜0.05)而CALD1芯片數(shù)據(jù)缺失、DA852857與芯片相反。
　　 結(jié)論：生物信息學(xué)分析芯片數(shù)據(jù)初步建立了ADSCs脂向分化相關(guān)調(diào)控基因、細胞因子網(wǎng)絡(luò)圖; AK304548、BP216319及預(yù)測的靶基因ARHGEF2和