電分析化學(xué)方法用于水體中大腸桿菌快速檢測的應(yīng)用研究.pdf

1、大腸桿菌是水體污染程度的重要指示菌,是腸道中最普遍、數(shù)量最多的一類細(xì)菌。當(dāng)大腸桿菌由糞便尤其是腸道病患者糞便或醫(yī)院污水污染的水源排放后,它可引發(fā)傷寒、痢疾、霍亂等腸道疾病流行。根據(jù)報(bào)道,全球每年因感染致病性大腸桿菌至少可導(dǎo)致6.5億人發(fā)病,并引起約80萬5歲以下兒童死亡,在我國不少地區(qū)大腸桿菌在腹瀉病人的病原譜中也占首位。大腸桿菌在水體中不僅存在的數(shù)量與腸道疾病呈現(xiàn)一定的相關(guān)性,而且它的抗逆性也很強(qiáng),因此存在于溪流、河水、湖泊等與人類生

2、活密切相關(guān)的環(huán)境中的大腸桿菌已經(jīng)成為人類病原存在的-個(gè)重要指標(biāo),成為環(huán)境保護(hù)、食品衛(wèi)生、飲水衛(wèi)生和流行性病學(xué)領(lǐng)域中最重要的研究對象之一。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和環(huán)境問題的突出,美國、歐洲、日本等-些國家和地區(qū)先后制訂了總大腸桿菌條例,我國也在1997年5月在全國建立了大腸桿菌檢測網(wǎng)絡(luò),衛(wèi)生部在2002年4月也制訂了大腸桿菌O157:H7感染性腹瀉應(yīng)急處理方案。這些措施的實(shí)施對人體健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有十分重要的意義,而對大腸桿菌有效和快速的檢測

3、是這些工作得以順利進(jìn)行的前提和關(guān)鍵。 大腸桿菌的常規(guī)檢測方法主要包括多管發(fā)酵法、濾膜法、熒光法、生物檢測法等,常規(guī)方法是目前國內(nèi)大多數(shù)檢測機(jī)構(gòu)使用的方法。但是這些常規(guī)檢測方法要求條件很高,要求水樣采集后立即檢測,一般不超過4小時(shí),即使儲存于冰箱中,也不得超過24小時(shí),水樣中的大腸桿菌過多或過少都可能影響正確的檢測,再加上傳統(tǒng)方法檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn),這些技術(shù)已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代檢測需要,雖然有廠家推出了大腸桿菌測

4、定儀,但是測定所需時(shí)間也在24小時(shí)以上,況且樣品的預(yù)處理程序比較復(fù)雜。從我們所查到的資料看,目前還沒有一種方法能夠?qū)Υ竽c桿菌進(jìn)行快速計(jì)數(shù),這也嚴(yán)重影響了人們對大腸桿菌傳染源的判斷和防治,因此,快速計(jì)數(shù)大腸桿菌的研究對環(huán)境衛(wèi)生以及流行病學(xué)等方面都具有十分重要的意義。 目前主要發(fā)展了化學(xué)發(fā)光和熒光法,酶分析方法、免疫分析法、電化學(xué)安培法以及生物和化學(xué)傳感器方法,另外電泳和毛細(xì)管柱也開始在此領(lǐng)域應(yīng)用。JaapS.Sinninghe D

5、amste,J.Rishpon和Jinghong Li等人在細(xì)菌的檢測等方面曾做過不少工作,但這些方法對低濃度細(xì)菌的檢測還有欠缺,而且這些新方法的成本較高,方法本身的操作難度較大,難于實(shí)現(xiàn)智能化和儀器化。本論文的工作主要集中在將納米技術(shù)、電化學(xué)分析技術(shù)和傳感器制備技術(shù)相結(jié)合,開發(fā)了新型的電分析化學(xué)方法用于快速計(jì)數(shù)水體中的大腸桿菌。論文重點(diǎn)研究了納米修飾電極用于流動注射分析中對大腸桿菌的快速計(jì)數(shù)及其檢測的作用機(jī)理,制備了免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了對

6、水體中大腸桿菌的快速檢測,而且首次制備了海藻酸包裹鈷的磁性高分子微球并將其用于大腸桿菌的基因片斷的檢測,為實(shí)際水體樣品中大腸桿菌的檢測提供了廣泛的前景。 具體研究內(nèi)容如下： 1基于IrO2-Pd納米修飾電極流動注射安培分析快速檢測水體中大腸桿菌的研究 本文制備了IrO2-Pd納米修飾電極,利用流動注射-安培檢測方法,開展了水體中大腸桿菌的快速計(jì)數(shù)研究。在異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)作用下,大腸桿菌

7、體內(nèi)產(chǎn)生β-D-半乳糖苷酶。通過膜滲透劑PBN和溶菌酶Lysozyme對大腸桿菌細(xì)胞膜壁的作用,β-D-半乳糖苷酶從細(xì)胞體內(nèi)釋放出來,催化水解大腸桿菌培養(yǎng)介質(zhì)中的底物4-氨基酚-β-D-吡喃半乳糖(PAPG)產(chǎn)生4-氨基酚,而4-氨基酚的量與溶液中大腸桿菌的量成線性關(guān)系,通過檢測溶液中4-氨基酚的量就可以實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌的快速計(jì)數(shù)。為了提高檢測大腸桿菌的靈敏度,本文制備了IrO2-Pd納米修飾電極作為流動注射-安培檢測的電化學(xué)檢測器。實(shí)驗(yàn)

8、結(jié)果表明,大腸桿菌濃度在2.0×102～1.0×106cfu/mL,范圍內(nèi)時(shí),響應(yīng)電流與大腸桿菌的數(shù)量有很好的線性關(guān)系,大腸桿菌的檢測限為150 cfu/mL,整個(gè)實(shí)驗(yàn)所需要的時(shí)間為3小時(shí)。 2電化學(xué)免疫傳感器的制備及其用于水體中大腸桿菌的檢測 本文成功地實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)免疫傳感器用于水體中大腸桿菌的快速檢測。文中以金電極為工作電極,利用巰基物質(zhì)在金表面的自組裝特性,在金表面形成穩(wěn)定、有序、緊密的尾基為羧基的巰基乙酸(MAC

9、A)自組裝膜(Self-assembledMonolayers,SAMs),再利用偶聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的活化作用形成活性中間體,使抗體更有效的固定在自組裝膜上。實(shí)驗(yàn)表明EDC與NHS的偶聯(lián)增強(qiáng)了抗體連接在電極上的穩(wěn)定性,并大大提高了抗體在自組裝膜上的濃度,從而使免疫傳感器的靈敏度及精確度有了明顯的提高。在存在鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀氧化還原對的緩沖溶液中,測量電極經(jīng)各步處

10、理后的循環(huán)伏安曲線和電化學(xué)阻抗譜。循環(huán)伏安曲線可用來定性的分析電極表面的修飾狀況以及修飾層的穩(wěn)定性。根據(jù)電化學(xué)阻抗譜良好的界面表征特性,電子轉(zhuǎn)移電阻的改變最明顯,增幅最大。從而可以確定,免疫傳感器的修飾以及大腸桿菌的固定主要影響了電子轉(zhuǎn)移阻抗。由于抗體抗原的特異性結(jié)合,通過分析在不同濃度大腸桿菌溶液中電子轉(zhuǎn)移阻抗的變化,實(shí)現(xiàn)了對大腸桿菌的定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大腸桿菌濃度在3×103～3×107cfu/mL范圍內(nèi)的對數(shù)值與溶液中的電子

11、傳遞阻抗呈線性關(guān)系,檢測限為1×103cfu/mL。通過富集和濃縮過程,此方法用于地表水中大腸桿菌數(shù)目的檢測,可檢測至50cfu/mL。 3基于磁性納米顆粒的DNA電化學(xué)生物傳感器用于水體中大腸桿菌檢測的研究 本文研制了具有高靈敏度和高選擇性的基于磁性高分子微球的電化學(xué)DNA生物傳感器,并將其用于大腸桿菌的檢測。以海藻酸包裹鈷的磁性高分子微球作為DNA探針的固體基質(zhì),根據(jù)大腸桿菌細(xì)胞體內(nèi)uid A 基因合成了特異性的DN

12、A序列,制備了用于大腸桿菌檢測的DNA探針。雜交過程中對嵌入式雜交指示劑柔紅霉素在雜交前后分別進(jìn)行電化學(xué)檢測,由雜交前后電化學(xué)信號的變化即可實(shí)現(xiàn)對大腸桿菌的檢測。文中利用透射電鏡(TEM)技術(shù)對制備的磁性高分子微球進(jìn)行了表征,并用紅外光譜證實(shí)了特定序列DNA片斷與磁性高分子微球的成功連接。并且我們還利用非互補(bǔ)DNA序列、三個(gè)堿基錯(cuò)配的DNA序列及完全互補(bǔ)序列驗(yàn)證了文中制備的DNA探針的選擇性。此外,我們利用完全互補(bǔ)DNA序列對雜交反應(yīng)的