基于PCR-FRET的大腸桿菌快速檢測新方法的建立.pdf

1、在自然環(huán)境中，飲用水水源很容易受到病原微生物的侵染，被污染的水體中，通常能檢測出大量的致病菌和腸道病毒。大腸桿菌作為水源中病原菌的標(biāo)準指示菌，對水質(zhì)安全監(jiān)測具有重要意義，我國國標(biāo)GB5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準中嚴格規(guī)定:飲用水的大腸桿菌限值為每100mL不得檢出。然而，目前大腸桿菌的標(biāo)準檢測方法仍以傳統(tǒng)檢測方法為主，這些檢測方法耗時長、操作繁瑣，不適合對水樣進行實時監(jiān)控。如何快速準確檢測出水體中大腸桿菌稱為人們研究的熱點。

2、r>　　本論文圍繞大腸桿菌快速檢測來展開研究工作，選取高特異性、高靈敏度的PCR和具有準確定量的FRET原理來實現(xiàn)對大腸桿菌的檢測。
　　首先建立普通PCR法。選取大腸桿菌的特異性保守性基因uidA作為目標(biāo)檢測物，對uidA進行引物設(shè)計后進行PCR實驗，在保證引物的特異性和準確性后克隆成質(zhì)粒，并根據(jù)質(zhì)粒對PCR擴增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行篩選和調(diào)控，最后得到最佳的PCR擴增條件。
　　然后建立QDs-Cy5基的FRET檢測體

3、系。選取反應(yīng)條件溫和的水相回流法來合成CdTe量子點，通過調(diào)節(jié)回流時間得到一系列發(fā)光效率較好的量子點。選取量子產(chǎn)率為53％、發(fā)射在602 nm的CdTe量子點為FRET的供體，根據(jù)F(o)rster原理對比量子點與染料的吸收和發(fā)射光譜，選取在600 nm左右有較強吸收的花菁染料Cy5作為FRET的受體。根據(jù)目的DNA設(shè)計的一組適配子，與供受體對連接后形成捕獲探針和報告探針，兩組探針可與目的DNA特異性結(jié)合形成夾心結(jié)構(gòu)并通過FRET來實現(xiàn)

4、對目的DNA的檢測。對檢測中可能影響的因素進行適當(dāng)調(diào)控后，成功對uidA基因進行了檢測，其檢測限為2 nmol/L，且在2nmol/L-100 nmol/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)為0.999。
　　最后聯(lián)立PCR-FRET，其可在3h內(nèi)完成對大腸桿菌的檢測。對uidA基因的檢測結(jié)果顯示其可檢測到30copies的uidA，比普通PCR法的檢測限約低一個數(shù)量級;該方法可檢測大腸桿菌濃度在103-107 CFU/mL范圍內(nèi)的