腎上腺素α1受體在人食管下括約肌的表達研究.pdf

1、目的:原發(fā)性食管運動功能障礙性疾病如賁門失弛緩癥、胡桃夾食管、高張性LES等是一類嚴重影響人們生活質(zhì)量的疾病。這類疾病往往伴有一些典型癥狀，如下咽困難等。近些年來，隨著人群生活水平提高和食管測壓和24小時PH檢測等檢查儀器的應用，原發(fā)性食管運動功能障礙性疾病的發(fā)現(xiàn)病例有所升高。但有關(guān)此類疾病的病因和發(fā)病機制尚不完全明確。研究顯示，原發(fā)性食管運動功能障礙性疾病和多種因素有關(guān)。神經(jīng)、激素調(diào)節(jié)、精神心理因素、炎癥反應、病毒感染及自身免疫因素等

2、均可能參與了原發(fā)性食管運動功能障礙性疾病的發(fā)病。
　　人食管下括約肌(Lower esophageal sphincter, LES)位于食管胃連接部。研究顯示，LES由套索纖維（sling fibers，SF）和鉤狀纖維(clasp fibres，CF)組成。其在機體多種因素的調(diào)節(jié)下協(xié)同膈腳調(diào)節(jié)食管下段腔內(nèi)壓。這個位于食管胃連接部的高壓帶具有重要的生理意義。如同閥門樣的作用使其在生理抗反流中發(fā)揮關(guān)鍵作用。而其功能的紊亂可導致多種

3、食管運動功能障礙性疾病。研究此處的調(diào)節(jié)機制對胃食管返流類疾病和食管運動功能障礙性疾病具有重要意義。
　　腎上腺素α1受體(α1-AR)及其亞型屬于G蛋白偶聯(lián)受體，在人和哺乳動物體內(nèi)廣泛表達。現(xiàn)有研究提示，α1-AR對于平滑肌收縮的調(diào)節(jié)較為重要，但既往關(guān)于α1-AR表達的研究主要集中于血管、生殖泌尿、肝臟和腎臟等器官。對于胃腸道研究較少。尚未有對人LES的α1-AR受體及其亞型表達分布和功能的研究。
　　本實驗通過蛋白印跡法(

4、Western-blot)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)來研究α1-AR及其受體亞型α1A-AR,α1B-AR，α1D-AR的mRNA和蛋白受體在食管平滑肌、套索纖維、鉤狀纖維和胃底平滑肌的表達水平。通過本項研究完善LES受體的表達規(guī)律，為此后α1-AR受體功能的研究和治療食管運動功能障礙性疾病提供理論基礎。
　　方法:選取因高位食管癌行食管大部切除術(shù)的患者30例。在手術(shù)室收集新鮮食管胃結(jié)合部標本，仔細游離套索纖維肌條、鉤狀

5、纖維肌條、胃底和食管環(huán)形肌肌條。提取組織總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應用3種α1-AR的引物行RT-PCR。分析擴增產(chǎn)物中目的條帶的光密度值(IOD)。各肌條中mRNA的相對含量為α1-AR各亞型與內(nèi)參(β-actn)的比值大小代表。提取組織總蛋白，BCA法測量蛋白濃度后將蛋白調(diào)整至相同濃度，電泳分離出α1-AR個亞型后轉(zhuǎn)膜，再分別應用α1-AR的各個亞型抗體進行孵育，沖洗一抗后孵育熒光二抗，沖洗后經(jīng)紅外熒光成像，最后經(jīng)Imagej軟件

6、分析各反應條帶的光密度值(IOD)。各肌條中受體蛋白的相對含量為α1-AR各亞型與內(nèi)參(GAPDH)的比值大小代表。
　　結(jié)果:
　　1 RT-PCR結(jié)果顯示，三種α1受體亞型的mRNA在各肌條均有表達:分別是α1A-AR，α1B-AR,α1D-AR。α1A-AR它在食管平滑肌、套索纖維、鉤狀纖維和胃底平滑肌表達水平分別為1.307±0.118;1.350±0.177;1.289±0.180;1.361±0.268;α1B-

7、AR表達水平依次為1.222±0.151;1.279±0.237;1.309±0.263;1.352±0.267;α1D-AR表達水平依次為1.258±0.297;1.323±0.237;1.310±0.295;1.282±0.288;同一種肌條組織中，α1-AR的三種受體亞型的表達量無統(tǒng)計學差異(F=0.530，P=0.590)。同一種α1-AR受體亞型中，四種肌條間mRNA的表達無差異(F=0.037，P=0.910)。
　　

8、2 Western-blot結(jié)果顯示，三種α1受體亞型均有其相應蛋白條帶的表達:分別是α1A-AR，α1B-AR，α1D-AR。α1A-AR它在食管平滑肌、套索纖維、鉤狀纖維和胃底平滑肌表達水平分別為0.431±0.118;0.474±0.177;0.503±0.180;0.485±0.268;α1B-AR表達水平依次為0.335±0.151;0.458±0.237;0.459±0.263;0.465±0.267;α1D-AR表達水平依

9、次為0.459±0.297;0.524±0.237;0.511±0.295;0.483±0.288;同一種肌條組織中，α1-AR三種受體亞型的表達量無統(tǒng)計學差異(F=0.208，P=0.813)。同一種α1-AR受體亞型中，四種肌條間蛋白的表達無差異(F=0.188，P=0.905)。
　　結(jié)論:α1A-AR,α1B-AR,α1D-AR在人LES均表達。其表達水平在同種受體和同種肌條間無明顯差異。可能在人LES的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著作