人食管下括約肌多巴胺受體的表達規(guī)律.pdf

1、目的：人食管下括約?。↙ES）是位于食管胃連接部特殊增厚的環(huán)形肌，其寬度約2-3cm。Liebermann-Meffert等首次提出人LES由位于胃小彎側呈半環(huán)形的鉤狀纖維（clasp fibres）和位于大彎側呈斜行分布的套索纖維（sling fibres）共同構成，這兩束肌纖維與膈腳一起在食管胃結合部形成高壓帶，維持LES的關閉狀態(tài)，使LES形成一種類似單向閥門的結構。正常狀態(tài)下，由于LES的持續(xù)性收縮使胃內容物不能反流入食管，另一

2、方面，由于LES的適時舒張允許了食物繼續(xù)下行入胃，或嘔吐和打嗝，使胃內的液體或氣體反流如食管并經口腔排出。LES的收縮和舒張功能調節(jié)機制非常復雜，包括了神經系統(tǒng)、體液因素及自身肌源性等多種因素。多巴胺（DA）受體作為G蛋白偶聯(lián)受體家族重要的受體類型之一，廣泛存在于哺乳動物的中樞及外周神經系統(tǒng)，并發(fā)揮著重要的作用。到目前為止已經發(fā)現它有D1R-D5R五種亞型，通過對腺苷酸活化酶活性的調節(jié)，可以實現不同部位平滑肌的收縮與舒張。按照其亞型對腺

3、苷酸活化酶活性的不同作用，又將DA受體分為兩大類即D1樣受體（D1R、D5R）和D2樣受體（D2R、D3R、D4R）。D1樣受體激活腺苷酸活化酶活性，而D2樣受體降低激活腺苷酸活化酶活性。但目前國內外對人LES受體類型及其分型以及調節(jié)機制的研究，主要局限于膽堿能受體，對于DA受體的研究則相對甚少?，F有的對食管粘膜DA受體的研究也主要是針對動物（負鼠等），與人有著種屬，生理學的差異，對于人LES的DA受體的表達規(guī)律及調節(jié)機制的相關研究則未

4、見報告。本試驗采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白印跡法（Western-blot）研究人LES的DA受體的5種亞型在套索纖維、鉤狀纖維、食管環(huán)行肌和胃底環(huán)行肌中mRNA、受體蛋白的表達規(guī)律，為進一步研究DA受體在人LES調節(jié)機制中的作用奠定基礎，從而更為完善的闡述人LES調節(jié)機制，為食管運動功能障礙性疾病的臨床治療提供理論依據。
　　 方法：
　　 1選取2007年12月到2008年10月在我院因高位食管中段癌

5、行食管大部切除術患者30例，其中男性23例，女性7例。手術室采集新鮮食管胃連接部手術標本，銳性剝去胃賁門部及食管下段的粘膜層及粘膜下層后，制備套索纖維（S）、鉤狀纖維（C）、食管體部環(huán)行肌（E）和胃底環(huán)行?。℅）的肌條；
　　 2按照1ml Trizol/100mg標本的比例加入Trizol，4℃條件下用組織勻漿器加充分研磨組織，然后依次通過氯仿萃取，異丙醇沉淀和75％乙醇的洗滌作用最終制備出組織RNA。DEPC水溶解，經紫外分

6、光光度計和1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度和完整性之后，應用5種DA受體亞型的引物行RT-PCR，檢測其mRNA在4種肌條的表達，經Gel Pro軟件分析擴增產物的光密度值（IOD），并計算DA受體亞型與β-actin IOD的比值表示mRNA的相對含量；
　　 3按照100ul TBS/10mg標本的比例加入TBS，4℃條件下用組織勻漿器加入TBS液勻漿，勻漿液（4℃，1000×g）離心10分鐘。棄上清后，以美國PIERCE公司的

7、膜蛋白提取試劑盒制備膜受體蛋白，考馬斯亮藍G-250定量，調整蛋白至相同濃度后，應用電泳儀電泳，分離出與5種。DA受體亞型的分子量大小相應的蛋白后轉膜，最后應用DA受體亞型抗體行Western blot檢測蛋白的表達，并分析IOD值。
　　 結果：
　　 1.RT-PCR經紫外分光度計測定，提取的總RNAA260/A280的值是1.8-1.9；1％瓊脂糖凝膠電泳顯示，28S帶的寬度及亮度是18S帶的兩倍。內參照β-act

8、in在838bp處亮度均勻，在各反應中，擴增結果基本一致。有3種DA受體亞型mRNA在各肌條中均有表達，分別是D1R，D2R，D5R，擴增產物的長度與預計的一致，分別為455、279、363bp。相同肌條不同DA受體亞型與β-actin IOD比值有統(tǒng)計學差異（F=5741.75，p=0.00），兩兩比較3種受體亞型mRNA表達從強到弱順序依次為D1R，D5R，D2R，相同的受體亞型不同的肌條間mRNA的表達無統(tǒng)計學差異。另外兩種受體亞

9、型D3R，D4R的mRNA在四種肌條中均無表達。
　　 2.Western blot3種DA受體亞型有其相應蛋白條帶的表達，分別是D1R，D2R，D5R，分子量分別為51、51、53。相同肌條不同受體亞型蛋白表達的IOD值有統(tǒng)計學差異（F=8453.308，p=0.00），兩兩比較3種受體亞型蛋白表達從強到弱的順序為D1R，D5R，D2R。相同受體在個肌條間沒有蛋白表達的差異另外兩種受體亞型D3R，D4R的蛋白在四種肌條中均無表