抗藥性相關(guān)NYD-Ch和NYD-Tr基因表達與初步鑒定.pdf

1、該研究根據(jù)本實驗室獲得的全長NYD-Ch和NYD-Tr基因序列,運用PCR方法從構(gòu)建好的抗性品系cDNA文庫中擴增出兩基因完整開讀框,通過基因重組方法,成功構(gòu)建NYD-Ch和NYD-Tr基因原核和真核表達載體,并初步探討了兩基因的原核誘導(dǎo)表達.為后續(xù)研究NYD-Ch和NYD-Tr基因抗性品系中高表達在淡色庫蚊抗性產(chǎn)生中的分子機制、媒介抗生產(chǎn)生機理以及媒介綜合防治奠定基礎(chǔ).第一部分:抗性相關(guān)基因NYD-Ch和NYD-Tr原核、真核表達載體

2、的構(gòu)建,根據(jù)本實驗室報道的在淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系中高表達的NYD-Ch和NYD-Tr基因的cDNA全長序列,設(shè)計引物,從本實驗室構(gòu)建的淡色庫庫蚊溴氰菊酯抗性品系全長cDNA文庫中,通過PCR方法獲取基因的完整開讀框序列.結(jié)論:pGEM-T/NYD-Ch和pGEM-T/NYD-Tr基因測序表明,所擴增基因為所需要的目的NYD-Ch和NYD-Tr基因,引物設(shè)計酶切位點正確.第二部分:多克隆抗CHY和TRY抗體制備和抗性的初步檢測,用牛C

3、HY和TRY蛋白,通過長程免疫小鼠的方法,制備小鼠抗牛CHY和TRY多克隆抗體.第三部分:抗藥性相關(guān)基因NYD-Ch和NYD-Tr原核誘導(dǎo)表達和鑒定,陽性樣本重新SDS-PAGE膠電泳后,電轉(zhuǎn)膜至NC膜上后,用第二部分制備的小鼠抗血清作為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗小鼠IgG抗體作為二抗,通過Western blot方法初步鑒定蛋白誘導(dǎo)表達.結(jié)果:用1mM的IPTG誘導(dǎo)菌液2小時后,與空載相比能看到一個大約33kD的蛋白條帶,和設(shè)計一致.