抗藥性相關(guān)NYD-Ch和NYD-Tr基因表達(dá)與初步鑒定.pdf

1、該研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的全長(zhǎng)NYD-Ch和NYD-Tr基因序列,運(yùn)用PCR方法從構(gòu)建好的抗性品系cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出兩基因完整開(kāi)讀框,通過(guò)基因重組方法,成功構(gòu)建NYD-Ch和NYD-Tr基因原核和真核表達(dá)載體,并初步探討了兩基因的原核誘導(dǎo)表達(dá).為后續(xù)研究NYD-Ch和NYD-Tr基因抗性品系中高表達(dá)在淡色庫(kù)蚊抗性產(chǎn)生中的分子機(jī)制、媒介抗生產(chǎn)生機(jī)理以及媒介綜合防治奠定基礎(chǔ).第一部分:抗性相關(guān)基因NYD-Ch和NYD-Tr原核、真核表達(dá)載體

2、的構(gòu)建,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的在淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性品系中高表達(dá)的NYD-Ch和NYD-Tr基因的cDNA全長(zhǎng)序列,設(shè)計(jì)引物,從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的淡色庫(kù)庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性品系全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中,通過(guò)PCR方法獲取基因的完整開(kāi)讀框序列.結(jié)論:pGEM-T/NYD-Ch和pGEM-T/NYD-Tr基因測(cè)序表明,所擴(kuò)增基因?yàn)樗枰哪康腘YD-Ch和NYD-Tr基因,引物設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)正確.第二部分:多克隆抗CHY和TRY抗體制備和抗性的初步檢測(cè),用牛C

3、HY和TRY蛋白,通過(guò)長(zhǎng)程免疫小鼠的方法,制備小鼠抗牛CHY和TRY多克隆抗體.第三部分:抗藥性相關(guān)基因NYD-Ch和NYD-Tr原核誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定,陽(yáng)性樣本重新SDS-PAGE膠電泳后,電轉(zhuǎn)膜至NC膜上后,用第二部分制備的小鼠抗血清作為一抗,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)羊抗小鼠IgG抗體作為二抗,通過(guò)Western blot方法初步鑒定蛋白誘導(dǎo)表達(dá).結(jié)果:用1mM的IPTG誘導(dǎo)菌液2小時(shí)后,與空載相比能看到一個(gè)大約33kD的蛋白條帶,和設(shè)計(jì)一致.