棉鈴蟲抗藥性相關(guān)P450基因側(cè)翼序列分離與轉(zhuǎn)座子插入鑒定.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)是世界性的重要經(jīng)濟(jì)害蟲，細(xì)胞色素P450是生物體中一類重要的代謝酶類，昆蟲P450介導(dǎo)的代謝解毒作用增強(qiáng)是昆蟲對多種殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制。最近的研究表明，轉(zhuǎn)座子插入是P450基因過表達(dá)的一個重要機(jī)制。本文利用基因組步移獲得棉鈴蟲多個抗性相關(guān)P450基因的基因組5'和3'側(cè)翼序列，利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)方法從棉鈴蟲基因組中鑒定了3種新型SINE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子多個拷貝序列，其

2、中HaSE1和HaSE2是tRNA衍生SINE轉(zhuǎn)座子，HaSE3是5SrRNA衍生SINE轉(zhuǎn)座子。研究結(jié)果對于明確昆蟲P450基因的進(jìn)化適應(yīng)以及昆蟲SINE轉(zhuǎn)座子的分子進(jìn)化具有重要意義。
　　 根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的棉鈴蟲抗藥性相關(guān)P450基因CYP9A12、CYP9A14和CYP6AE12以及棉鈴蟲近緣種HelicoverpaZea抗藥性相關(guān)CYP321A1基因的cDNA序列，通過genomewalking獲得了多個P450基因5'和

3、/或3'側(cè)翼基因組序列，發(fā)現(xiàn)CYP6AE12基因、CYP9A14基因和CYP321A1基因的5'側(cè)翼序列存在GATA-1、Oct-1、C/EBP、BR-CZ、CdxA和HSF等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。這些轉(zhuǎn)錄因子可能在特異性調(diào)控抗性相關(guān)P450基因的表達(dá)中具有一定的作用。此外，在棉鈴蟲CYP6AE12基因5'側(cè)翼序列和3'側(cè)翼序列分別發(fā)現(xiàn)一個Helitron類轉(zhuǎn)座子Lep1和一個SINE反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子HaSE1.1的插入。
　　 對

4、棉鈴蟲CYP6AE12基因的基因組5'側(cè)翼序列的分析發(fā)現(xiàn)了一個新的P450基因，進(jìn)一步通過RT-PCR獲得了棉鈴蟲一個新的CYP6家族P450基因的1730bpcDNA序列，編碼521個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為14.35kD，等電點(diǎn)為4.98。該基因與CYP6AE12基因在氨基酸水平上具有74％的一致性。
　　 以通過基因組步移獲得的棉鈴蟲CYP6AE12基因的基因組3'側(cè)翼序列作為信息探針，應(yīng)用blastn鑒定獲得21個全長

5、HaSE1拷貝序列，命名為HaSE1.2-HaSE1.22。對所有鑒定的全長HaSE1拷貝的序列分析發(fā)現(xiàn)，這些序列都具有典型的tRNA衍生SINE轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)特征:側(cè)翼為5-18bp的靶標(biāo)位點(diǎn)重復(fù)(targetsiteduplication，TSD);5'端為具有Abox和Bbox（RNA聚合酶Ⅲ啟動子特征性基序）的tRNA相關(guān)區(qū);3'末端具有完整或者不完整的TGA重復(fù)。利用ClustalW進(jìn)行多重序列比對獲得的HaSE1一致序列長38

6、6bp，包括與黑腹果蠅tRNAArg（GenBank登錄號:V00243）具有58％同源性的74bp的tRNA相關(guān)區(qū)。序列對比發(fā)現(xiàn)，HaSE1一致序列3'末端43bp序列與從棉鈴蟲BAC克?。℅enBank登錄號:FP340435;位置:64987-66631）中鑒定的LINE轉(zhuǎn)座子HaRTE1.1的3'末端具有82％的同源性。HaRTE1.1長1645bp，側(cè)翼為15bp的靶標(biāo)位點(diǎn)重復(fù)(TSD)，編碼的反轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列與家蠶RTE-

7、3-BM具有42％的一致性，3'非翻譯區(qū)末端為TGA重復(fù)。
　　 以HaSE1的74bp的tRNA相關(guān)區(qū)作為信息探針，應(yīng)用blastn鑒定獲得7個HaSE2拷貝序列，命名為HaSE2.1-HaSE2.7。HaSE2的一致序列長286bp，5'端132bp序列與HaSE1具有94％的序列一致性，包括70bp的tRNA相關(guān)區(qū)和62bp的保守性中央?yún)^(qū)。值得注意的是，HaSE2一致序列154bp的3'端與從棉鈴蟲中分離的mariner類

8、轉(zhuǎn)座子Hamar1.3具有98％的序列同源性。這是第一次報(bào)道關(guān)于一個SINE家族的3'端由DNA轉(zhuǎn)座子衍生而來。這很可能是由于HaSE2的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物整合到mariner轉(zhuǎn)座子的基因組拷貝中，也有可能是模板轉(zhuǎn)換(templateswitching)過程中由于tRNA和mariner轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物發(fā)生重組造成。
　　 應(yīng)用blastn和PCR從棉鈴蟲基因組中鑒定和分離獲得16個HaSE3拷貝，命名為HaSE3.1-HaSE3.16

9、。序列比對表明，HaSE3的一致序列的3'端與HaSE1的一致序列的3'端具有94％的序列同源性，表明該HaSE3家族可能來源于反轉(zhuǎn)座cDNA合成過程中tRNA衍生HaSE1的RNA與5SrRNA的模板轉(zhuǎn)換。因此，本文的研究首次發(fā)現(xiàn)了昆蟲的一個5SrRNA衍生SINE家族來源于5SrRNA和tRNA衍生SINE的重組。
　　 對GenBank數(shù)據(jù)庫的同源檢索發(fā)現(xiàn)，HaSE1存在于棉鈴蟲的兩個近緣種美洲棉鈴蟲和煙芽夜蛾中。同樣，H