喉癌中SP100表達(dá)及生物學(xué)功能研究.pdf

1、前言
　　 喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤,發(fā)病率約占全身腫瘤的1-5％,并且發(fā)病率呈不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì):北美每年有13000例患者被診斷為原發(fā)性喉癌；在我國(guó),喉癌的發(fā)病率在呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤中占據(jù)第二位,華北、東北地區(qū)是喉癌的高發(fā)區(qū)。手術(shù)是目前治療的主要手段,盡管早期喉癌患者的生活質(zhì)量由于喉部分切除術(shù)的應(yīng)用得到了較大的改善,但晚期喉癌患者的生活質(zhì)量及生存率在最近的30年中無(wú)明顯變化。喉癌發(fā)生的病理分子機(jī)制仍不清楚,探討其發(fā)生、發(fā)展的分子

2、機(jī)制無(wú)論對(duì)喉癌的早期診斷,還是有效治療都具有重要意義。在前期的工作中,我們發(fā)現(xiàn)在喉癌組織中表達(dá)下調(diào)的SH3GL2蛋白在喉癌細(xì)胞系中可以和SP100蛋白結(jié)合而相互作用,提示SP100蛋白可能與喉癌的發(fā)生和進(jìn)展相關(guān),在喉癌發(fā)生演進(jìn)中發(fā)揮一定的作用。
　　 SP100蛋白,全名為SP100核抗原(SP100 nuclear antigen),屬早幼粒白血病核小體(promyelocytic Leukaemia nuclear body

3、,PML NBs)相關(guān)蛋白家族成員,含有SP100HMG、SP100A、SP100B和SP100C四種異構(gòu)體。4種SP100蛋白異構(gòu)體在氨基端共享同源SP100結(jié)構(gòu)域,不同異構(gòu)體在羧基端的SAND、PHD(planthomeodomain zinc finger)、Bromo或HMG(High Mobility Group,高遷移率組)結(jié)構(gòu)域存在差別。SP100蛋白己被證實(shí)參與病毒感染、病毒相關(guān)蛋白相互作用、自身泛素化調(diào)節(jié),并在干擾素、

4、p53等多個(gè)信號(hào)通路中發(fā)揮作用。目前有關(guān)其在人體腫瘤中的研究尚未見報(bào)道。
　　 在本研究中,我們將明確SP100基因在不同腫瘤細(xì)胞系及喉癌大體組織標(biāo)本中的表達(dá)方式。同時(shí),深入研究SP100HMG的生物學(xué)功能及其與SH3GL2蛋白的相互作用方式。一方面可為闡明SP100基因在喉癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制創(chuàng)造條件并提供新的線索,另一方面為開展以SP100HMG為靶點(diǎn)或通過(guò)蛋白相互作用設(shè)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的喉癌診斷和治療奠定基礎(chǔ)。

5、>　　 材料與方法
　　 通過(guò)半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)SP100基因mRNA在人喉癌Hep2細(xì)胞系、人宮頸癌HeLa細(xì)胞系、人肝癌Bel細(xì)胞系、人胃癌SGC7901和BGC823細(xì)胞系、人胚腎HEK293細(xì)胞系和胎兒胃上皮GES細(xì)胞系中的表達(dá)情況。選取2004年1月-006年12月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌的病例96例,收集喉癌組織及癌旁黏膜組織標(biāo)本及相應(yīng)病例臨床資料,采用RT-PCR、

6、Western Blot和免疫組織化學(xué)方法研究SP100基因在喉癌大體組織標(biāo)本中表達(dá)情況,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析臨床病理資料與SP100表達(dá)間的關(guān)系。
　　 通過(guò)RT-PCR分析SP100HMG轉(zhuǎn)錄本在人喉癌Hep2細(xì)胞系、人宮頸癌HeLa細(xì)胞系、人肝癌Bel細(xì)胞系、人胃癌SGC7901細(xì)胞系、BGC823細(xì)胞系、MKN細(xì)胞系、人胚腎HEK293細(xì)胞系和胎兒胃上皮GES細(xì)胞系中的表達(dá)情況；構(gòu)建RFP-SP100HMG表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染H

7、ep2細(xì)胞,通過(guò)Western blot和RT-PCR檢測(cè)Hep2細(xì)胞中SP100HMG表達(dá)水平,同時(shí)觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞體外侵襲能力和細(xì)胞凋亡水平的變化,綜合分析SP100HMG在喉癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)和免疫熒光技術(shù)分析SP100HMG和SH3GL2蛋白結(jié)合及區(qū)域定位；通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)SP100HMG-SH3GL2結(jié)合區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè),構(gòu)建該結(jié)合區(qū)域肽鏈表達(dá)載體、通過(guò)免疫共沉淀對(duì)SP100HMG

8、-SH3GL2的蛋白結(jié)合區(qū)域進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)一步揭示其參與蛋白質(zhì)間結(jié)合的肽鏈片段。
　　 結(jié) 果
　　 1、半定量和實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果表明Hep2、HeLa、Bel、SGC7901、BGC823腫瘤細(xì)胞系中SP100 mRNA水平較黏膜上皮細(xì)胞系GES降低；
　　 2、RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,喉癌組織中SP100 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于癌旁對(duì)照組織,蛋白表達(dá)下調(diào)水平與mRNA表達(dá)下

9、調(diào)水平一致；
　　 3、免疫組織化學(xué)分析SP100蛋白表達(dá)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),蛋白表達(dá)水平與喉癌細(xì)胞病理分化程度相關(guān),低水平表達(dá)時(shí)SP100蛋白從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)移位；
　　 4、RT-PCR結(jié)果顯示在Hep2、HeLa、Bel、SGC7901、BGC823、MKN腫瘤細(xì)胞系中SP100HMG mRNA水平較黏膜上皮細(xì)胞系GES降低；
　　 5、RFP-SP100HMG表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞后,細(xì)胞中SP100蛋

10、白表達(dá)水平顯著增加,RT-PCR顯示SP100HMG表達(dá)水平亦顯著增加:
　　 6、SP100HMG對(duì)人喉癌Hep2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:RFP-SP100HMG表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞可以觀察到明亮的紅色熒光蛋白表達(dá),轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)明顯變圓、邊緣變鈍,細(xì)胞凋亡率增高、侵襲力顯著降低,細(xì)胞增殖水平較對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯變化；
　　 7、免疫共沉淀顯示SP100HMG和SH3GL2在Hep2細(xì)胞內(nèi)結(jié)合,免疫熒光顯示SP100HM

11、G定位于細(xì)胞核,SH3GL2定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),二種蛋白結(jié)合區(qū)域定位于細(xì)胞核；
　　 8、生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并經(jīng)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)SP100HMG蛋白與SH3GL2蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于SAND-HMG區(qū)域。
　　 結(jié) 論
　　 1、SP100 mRNA在多個(gè)惡性腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào),參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展；
　　 2、喉癌組織中SP100在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上表達(dá)下調(diào),是潛在的喉癌相關(guān)的抑癌基因；
　　 3、喉

12、癌組織中SP100蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞內(nèi)分布狀況在不同分化程度癌細(xì)胞中存在顯著差異性,提示在喉癌的不同階段可能發(fā)揮不同的作用；
　　 4、SP100HMG在不同腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)水平較正常黏膜上皮細(xì)胞系表達(dá)下調(diào),在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用；
　　 5、SP100HMG具有抑制喉癌細(xì)胞侵襲并增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的能力,是喉癌相關(guān)的重要候選腫瘤抑制基因；
　　 6、SP100HMG通過(guò)SAND-HMG結(jié)構(gòu)域與SH3GL2