CIAPIN1在腫瘤中的生物學功能研究.pdf

1、第一部分 CIAPIN1在慢性粒細胞白血病K562細胞粒系分化中的作用
　　背景:造血是一個精細的調控過程，能使骨髓中不成熟的祖細胞最終分化成熟進入外周血。外周血中成熟的血細胞如中性粒細胞的生存期較短，以嚴格地調控其在外周血的正常數(shù)量。這就需要造血祖細胞適度的增殖、分化成熟或發(fā)生凋亡。造血祖細胞中造血基因精細的協(xié)調以及相互作用構成了這一復雜的造血過程。慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是

2、一類由基因突變導致的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，可使增殖失調、分化受阻，以及造血祖細胞生存延長[1]。K562細胞作為一株分化程度差、惡性程度高的細胞系，在合適的誘導條件下可以向紅系、粒系和巨核系多個方向分化。CIAPIN1(cytokine-induced apoptosis inhibitor1)是一個新近被證實和凋亡相關的因子，是獨立于凋亡調節(jié)分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的RAS信號轉導通路中的一個新調節(jié)分子。研究表明CIA

3、PIN1基因的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系，目前CIAPIN1基因在慢性粒細胞白血病中的作用尚未見報道。
　　目的:探討靶向干擾CIAPIN1基因對K562細胞粒系分化的影響，并研究其相關機制，為慢性粒細胞白血病的治療提供新的靶點。
　　方法:采用RNA干擾技術沉默K562細胞內的CIAPIN1基因，瑞氏染色和電鏡觀測細胞形態(tài)和超微結構的變化，實時定量PCR和流式細胞術檢測粒系分化標志基因的變化;采用western blo

4、tting技術檢測沉默CIAPIN1基因后NHE1表達的變化，進一步改變NHE1表達或活性，研究NHE1在K562細胞粒系分化中的作用及CIAPIN1與NHE1之間的調控關系;采用western blotting技術檢測NHE1表達改變對ERK1/2磷酸化的影響，進一步改變ERK1/2活性，研究ERK1/2信號通路在K562細胞粒系分化中的作用及NHE1與ERK1/2之間的調控關系。
　　結果:沉默CIAPIN1基因能促進K562

5、細胞向成熟的粒細胞階段分化;CIAPIN1基因表達下調引起NHE1表達降低和磷酸化ERK1/2表達升高;沉默CIAPIN1基因后，干擾NHE1表達或降低其活性進一步促進CIAPIN1下調引起的K562細胞分化，過表達NHE1則逆轉該分化過程;沉默CIAPIN1基因后，干擾或過表達NHE1分別引起磷酸化ERK1/2升高和降低，進一步抑制ERK1/2活性則逆轉NHE1下調或活性降低引起的K562細胞分化。
　　結論:沉默CIAPIN1

6、基因能促進K562細胞的粒系分化，CIAPIN1可直接靶向NHE1，通過下調NHE1引起K562細胞粒系分化，ERK1/2信號通路參與了該分化過程。CIAPIN1和NHE1可能成為慢性粒細胞白血病的潛在治療靶點。
　　第二部分 CIAPIN1在慢性粒細胞白血病K562細胞對伊馬替尼敏感性中的作用研究
　　背景:慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，

7、費城染色體(Ph)和bcr-abl融合基因的形成在其發(fā)病中發(fā)揮了關鍵作用。伊馬替尼為bcr-abl信號傳遞系統(tǒng)抑制劑，是慢性粒細胞白血病特異性的分子靶向藥物。雖然伊馬替尼對慢性粒細胞白血病患者尤其是慢性期患者具有很好的療效，但伴隨應用的積累和疾病的進展，仍然不可避免會出現(xiàn)伊馬替尼耐藥現(xiàn)象。為此，尋找不依賴bcr-abl激酶的新的有效治療靶點有望解決這一耐藥問題。CIAPIN1(cytokine induced apoptosis inh

8、ibitor1)是一個新近被證實和凋亡相關的因子，是獨立于凋亡調節(jié)分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的RAS信號轉導通路中的一個新的調節(jié)分子。研究表明CIAPIN1基因的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系，但目前CIAPlN1基因在慢性粒細胞白血病中的作用尚未見報道。伊馬替尼通過抑制bcr-abl陽性細胞增殖，促進細胞凋亡來發(fā)揮作用，CIAPIN1作為一凋亡相關因子，是否在慢性粒細胞白血病細胞對伊馬替尼敏感性中發(fā)揮了作用，需要進一

9、步研究探索。
　　目的:以慢性粒細胞白血病細胞系K562為研究對象，探究CIAPIN1基因在K562細胞對伊馬替尼敏感性中的作用及相關機制。
　　方法:1、對2011年8月～2012年8月本院收治的14例成人急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者，20例急性髓系白血病(acutemyeloid leukemia，AML)患者，37例慢性粒細胞白血病(chronic myel

10、oid leukemia，CML)患者及16例慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)患者骨髓標本進行研究，并收集8例正常供者骨髓標本為對照。分離單個核細胞，應用實時定量PCR方法檢測骨髓單個核細胞中CIAPIN1基因的表達水平。2、利用RNA干擾技術，構建靶向CIAPIN1基因的特異性干擾載體，穩(wěn)定轉染K562細胞。利用MTT實驗檢測K562細胞體外增殖活性，細胞集落形成實驗檢測細胞體外克

11、隆形成能力，流式細胞技術檢測細胞周期，Hoechst33258染色及AnnexinⅤ-APC/PI雙染檢測細胞凋亡，BALB/C裸鼠體內成瘤實驗檢測細胞裸鼠體內成瘤性。3、伊馬替尼同時處理轉染了空載體和CIAPIN1干擾載體的K562細胞。利用MTT實驗檢測K562細胞體外增殖活性，細胞集落形成實驗檢測細胞體外克隆形成能力，流式細胞技術檢測細胞周期，Hoechst33258染色及AnnexinⅤ-APC/PI雙染檢測細胞凋亡。4、應用w

12、estern blotting技術檢測Bcl-2和caspase家族凋亡相關蛋白的表達，檢測耐藥相關蛋白PgP的表達，檢測NF-κB信號通路相關蛋白IKKα、IKKβ、IκBα的表達及磷酸化IKKα/β、磷酸化IκBα的表達;免疫熒光技術觀察K562細胞內NF-κB p65的核定位。
　　結果:1、CIAPIN1基因在CML患者骨髓單個核細胞及CML細胞系K562中的表達明顯高于正常對照組(P＜0.05）。2、成功構建了CIAPI

13、N1穩(wěn)定干擾的K562細胞系。體外實驗表明:沉默CIAPIN1基因降低了K562細胞的增殖活性，抑制了細胞的克隆形成能力，將細胞周期阻滯在G1/S期，對細胞凋亡未見影響。體內實驗表明:沉默CIAPIN1基因抑制了K562細胞在BALB/C裸鼠體內的成瘤性。3、伊馬替尼處理后，沉默CIAPIN1基因降低了K562細胞的增殖活性，抑制了細胞的克隆形成能力，將細胞周期阻滯在G1/S期，促進了細胞凋亡。4、伊馬替尼處理后，沉默CIAPIN1基因

14、上調了Bid、Bim及cleaved PARP的表達，激活了caspase，下調了Bcl-xl、Bcl-2及Mcl-1的表達;沉默CIAPIN1基因下調了PgP的表達，CIAPIN1與PgP的表達存在正相關性;沉默CIAPIN1后，K562細胞中IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化水平降低，NF-κB的核內定位明顯減少，當CIAPIN1沉默的K562細胞經(jīng)NF-κB特異性抑制劑Bay11-7082(IκB磷酸化抑制劑)處理后，IKKα/β

15、和IκBα的磷酸化水平進一步降低，NF-κB在細胞核內的定位進一步減少，表明NF-κB信號通路活性進一步降低。
　　結論:CIAPIN1表達下調提高了K562細胞對伊馬替尼的敏感性，且至少是通過對Bcl-2、caspase家族及Pgp的調節(jié)來實現(xiàn)的;NF-κB信號通路在CIAPIN1介導的K562細胞對伊馬替尼敏感性中發(fā)揮了重要作用。
　　第三部分 CIAPIN1在乳腺癌MDA-MB-231細胞體外轉移中的作用研究
　

16、　背景:乳腺癌是女性惡性腫瘤中最常見的一種，腫瘤細胞的轉移是乳腺癌患者治療失敗和死亡的主要原因，因此深入研究乳腺癌轉移的機制無疑是需要迫切解決的一大難題。CIAPIN1是近年來通過克隆表達方法鑒定的一個新的凋亡抑制分子，被證實與多種惡性腫瘤密切相關，而在乳腺癌轉移中的作用尚未見報道。鈉氫交換蛋白1(Na+/H+ exchanger1，NHE1)是在哺乳動物中廣泛表達的一種整合膜蛋白，可以促進細胞內的H+和細胞外的Na+交換，從而維持細胞

17、內堿化和細胞外環(huán)境酸化的穩(wěn)態(tài)，而這種細胞內外酸堿穩(wěn)態(tài)對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關重要。大量研究已經(jīng)證實NHE1參與了許多實體瘤的轉移，其中包括乳腺癌，但是其詳細作用機制尚不清楚。
　　目的:以乳腺癌細胞MDA-MB-231為研究對象，探討CIAPIN1在其轉移中的生物學作用及相關機制，并在此基礎上初步闡明CIAPIN1和NHE1之間的調控機制，為尋找乳腺癌新的治療策略提供理論依據(jù)。
　　方法:1、采用實時定量PCR和wester

18、n blotting技術檢測CIAPIN1在侵襲能力不同的乳腺癌細胞MDA-MB-231和MCF-7中的表達差異;2、構建CIAPIN1的慢病毒表達載體感染MDA-MB-231細胞，采用劃痕實驗和transwell實驗研究CIAPIN1在MDA-MB-231細胞體外轉移中的作用;3、采用實時定量PCR和western blotting技術檢測過表達CIAPIN1后NHE1表達的變化，改變NHE1活性，研究NHE1在MDA-MB-231細

19、胞體外轉移中的作用及CIAPIN1與NHE1之間的調控關系;4、采用western blotting技術檢測過表達CIAPIN1后改變NHE1活性對磷酸化ERK1/2表達的影響，采用ERK1/2信號通路抑制劑PD98059研究其在MDA-MB-231細胞體外轉移中的作用及NHE1與ERK1/2之間的調控關系;5、采用western blotting技術檢測過表達CIAPIN1后、抑制NHE1活性或/和磷酸化ERK1/2后基質金屬蛋白酶M

20、MP2和MMP9的表達變化。
　　結果:1、CIAPIN1在MDA-MB-231細胞中的表達低于其在MCF-中的表達;2、過表達CIAPIN1能抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵襲，下調MMP2和MMP9的表達;3、過表達CIAPIN1引起NHE1和磷酸化ERK1/2表達降低;4、過表達CIAPIN1后，抑制NHE1活性進一步抑制MDA-MB-231細胞的體外轉移，進一步下調MMP2和MMP9的表達;5、過表達CIAPI

21、N1后，抑制NHE1活性能顯著降低ERK1/2的磷酸化水平，同時抑制NHE1活性和ERK1/2磷酸化進一步抑制MDA-MB-231細胞的體外轉移，進一步下調了MMP2和MMP9的表達。
　　結論:過表達CIAPIN1能抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵襲。CIAPIN1可直接靶向NHE1，通過下調NHE1抑制MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲，ERK1/2信號通路參與了該過程。CIAPIN1和NHE1是乳腺癌潛在的治療