日本血吸蟲TOR基因克隆表達及生物學功能研究.pdf

1、血吸蟲病仍然是一個全球性公共衛(wèi)生問題，數(shù)以億計的人受其威脅。環(huán)境治理和藥物干預是當前防控的主要措施。研發(fā)高效、安全的疫苗是血吸蟲病持續(xù)控制的研究方向之一。宿主補體是宿主免疫殺傷寄生蟲的重要效應(yīng)因子，血吸蟲可以通過一些自身蛋白調(diào)節(jié)宿主補體級聯(lián)反應(yīng)而逃避宿主的免疫攻擊。血吸蟲體被表膜中具抑制補體功能的蛋白有可能成為疫苗候選分子。四跨膜孤兒受體(TOR)是一種多跨膜受體蛋白，具有補體C2結(jié)合位點，可抑制C3轉(zhuǎn)化酶的形成而調(diào)節(jié)補體級聯(lián)反應(yīng)。曼氏

2、血吸蟲TOR(SmTOR)的研究表明，該分子能誘導較高的保護效果。本文根據(jù)實驗室前期日本血吸蟲體被表膜蛋白質(zhì)組研究結(jié)果，開展了日本血吸蟲TOR(SjTOR)蛋白特性和生物學功能研究。
　　根據(jù)SjTOR參考序列，設(shè)計引物應(yīng)用PCR克隆得到SjTOR基因片段，長度為1245 bps，編碼414個氨基酸，比對分析顯示與SmTOR、埃及血吸蟲TOR(ShTOR)、錐蟲TOR相似性分別為77.0％、72.0％、和75.0％。序列分析顯示，

3、SjTOR不含信號肽，具有5個N糖基化位點:跨膜結(jié)構(gòu)預測表明，SjTOR包含四個跨膜結(jié)構(gòu)域。實時定量PCR結(jié)果顯示，SjTOR在蟲體發(fā)育的各個時期均有轉(zhuǎn)錄，在尾蚴時期轉(zhuǎn)錄水平最高，在雌蟲中的轉(zhuǎn)錄明顯高于雄蟲。免疫組化實驗結(jié)果表明SjTOR主要分布于蟲體的表膜，在實質(zhì)組織也有分布。
　　根據(jù)SjTOR第一個膜外區(qū)(SjTOR-ed1，AA47-168)序列設(shè)計合成引物，構(gòu)建含SjTOR第一個膜外區(qū)(SjTOR-ed1)基因的重組表達

4、質(zhì)粒pET-28a-SjTOR-ed1，在BL21（DE3）大腸桿菌中誘導表達，并用組蛋白親和層析純化獲得重組蛋白rSjTOR-ed1，分子量約為14 kDa。Western blot結(jié)果表明重組蛋白rSjTOR-ed1具有良好的免疫原性。用重組蛋白rSjTOR-ed1免疫小鼠，在兩次獨立的動物實驗中分別獲得了24.51％和26.51％的減蟲率及39.62％和32.92％的肝臟減卵率。ELISA結(jié)果表明重組蛋白rSjTOR-ed1能夠誘

5、導小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性IgG抗體，抗體亞型分析結(jié)果顯示，免疫重組蛋白rSjTOR-ed1能夠誘導產(chǎn)生IgG1和IgG2a抗體，且IgG1與IgG2a的比值在第4周達到最高后逐漸下降。
　　溶血試驗結(jié)果表明，重組蛋白rSjTOR-ed1能抑制補體溶血且在濃度為0.2～1.0μM之間時其補體抑制作用呈劑量依賴性，蛋白濃度為10μM時的溶血抑制率可達60.26％。補體C2結(jié)合試驗結(jié)果表明，重組蛋白rSjTOR-ed1可與補體C2結(jié)合

6、。根據(jù)SjTOR基因序列設(shè)計并合成4對特異的siRNAs，應(yīng)用浸泡法對體外培養(yǎng)的童蟲SjTOR進行干擾，實時定量PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，4對siRNAs對TOR基因的轉(zhuǎn)錄分別產(chǎn)生了45.12％、38.05％、25.46％、44.25％的干擾效果。
　　綜上，本文成功克隆了SjTOR基因，查明其在日本血吸蟲尾蚴中轉(zhuǎn)錄水平較高，主要表達分布在血吸蟲體被，并在大腸桿菌中表達純化到含其ed1的重組蛋白rSjTOR-ed1