淋巴細胞活化基因3(lag3)表達調控機制的研究.pdf

1、淋巴細胞活化基因3（lymphocyte-activation gene3，lag3），又稱CD223，是屬于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF）的細胞膜蛋白，其蛋白質結構與CD4分子非常相似，基因位置鄰近CD4。早期研究顯示，LAG3在人體內的表達局限于外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中的少數(shù)亞群上，如活化的T淋巴細胞和漿

2、細胞樣樹突狀細胞等。研究表明LAG3對T細胞功能的調節(jié)有重要作用，且與多種疾病狀態(tài)下的免疫失調相關，但lag3基因表達調控的機制依然不明確。本文利用LAG3表達水平有差異的3個T細胞系（CEM，Jurkat E6-1，Jurkat ZM細胞系），對T細胞中l(wèi)ag3基因表達調控的部分機制進行了研究，并發(fā)現(xiàn)位于轉錄調控區(qū)中的CpG島岸(CpG island shore)的DNA甲基化將抑制lag3基因的轉錄。
　　首先，我們從mRNA

3、和蛋白水平對實驗室現(xiàn)有T細胞系的LAG3表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)3個細胞系中LAG3表達有差異且受到轉錄水平調控。通過比對人與老鼠的基因組序列，鑒定到lag3啟動子中存在兩個潛在的保守調控區(qū)CRA和CRB(conserved region A&B)。利用DNaseⅠ高敏感位點的分析方法，我們發(fā)現(xiàn)在LAG3+的Jurkat E6-1細胞亞群中，CRA和CRB對DNaseⅠ的處理敏感。將包含CRA和CRB的lag3基因轉錄起始位點(transc

4、ription start site，TSS)上游片段擴增并構建報告質粒p.basic，發(fā)現(xiàn)該區(qū)段具有較高啟動子活性。進一步，通過截斷啟動子發(fā)現(xiàn)CRB是該啟動子區(qū)段中的核心序列，同時發(fā)現(xiàn)CRB在LAG3表達水平極低的CEM和Jurkat ZM細胞中亦具有高啟動活性，提示我們這兩種細胞內源的LAG3表達受到了表觀遺傳調控。接下來，我們利用Methprimer軟件預測到了一個位于轉錄區(qū)域的CpG島IS及其上游的位于CRB區(qū)的CpG島岸，亞硫

5、氰酸鹽測序PCR(bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測表明:IS處于穩(wěn)定的高度甲基化水平，而CpG島岸的DNA甲基化水平與LAG3在3個T細胞系上的表達水平負相關。利用DNA甲基轉移酶M.SssI將CRB體外甲基化可以顯著降低其啟動子活性，表明CRB甲基化對lag3基因轉錄具有抑制作用。此外，使用DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza-dc處理LAG3表達水平低的CEM和JurkatZM細胞，發(fā)現(xiàn)兩者的LAG3 mR

6、NA和蛋白表達水平均得到一定程度的提升，同時觀察到CRB甲基化水平的顯著降低。為了確定CRB甲基化對人原代T細胞中l(wèi)ag3基因的調控作用，我們檢測了原代T細胞的CRB甲基化，發(fā)現(xiàn):相較于作為LAG3表達陰性對照的B淋巴細胞，原代CD8+T淋巴細胞的各記憶亞群上CRB的甲基化水平均低。
　　綜上，我們的數(shù)據(jù)表明:發(fā)生在CpG島岸上的DNA甲基化對于人T細胞系中l(wèi)ag3基因轉錄而言是一種重要的表觀遺傳調節(jié)機制，而CRB的低甲基化水平可