骨形態(tài)形成蛋白4對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度影響及其機制初步研究.pdf

1、目的：探討骨形態(tài)形成蛋白4（BMP4）對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響及其機制，為進一步探究其在低氧性肺動脈高壓（HPH）發(fā)病過程的可能作用與機制打下基礎(chǔ)。
　　 研究內(nèi)容和方法：
　　 一、BMP4對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響
　　 將200-300g雄性Wistar大鼠麻醉后,取出心肺組織,置于顯微鏡下，用顯微鑷和顯微剪刀于顯微鏡下小心分離出遠端(4-5級)肺動脈,剝離內(nèi)外膜后,采

2、用膠原酶消化法獲得遠端肺動脈平滑肌細胞,將細胞種于放置在35mm培養(yǎng)皿內(nèi)的圓形載玻片上,培養(yǎng)至第三天細胞密度達到50％,將細胞隨機分為三個組:(1)未處理組,未給予刺激物; (2)對照組,用等量的BMP4溶解緩沖液處理PASMCs 60h; (3)BMP4組,用BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h。細胞用Fura-2在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，使Fura-2進入細胞內(nèi)，用熒光顯微鏡檢測，根據(jù)標準曲線，推算細胞內(nèi)Ca2+濃度。

3、r>　　 二、大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞TRPC1,6 mRNA和蛋白質(zhì)表達及其機理研究
　　 1、BMP4對PSMC表達TRPC1、6 mRNA和蛋白質(zhì)的影響：實驗采用原代培養(yǎng)大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞，培養(yǎng)至第五天細胞密度達到80-90％,將細胞隨機分為三個組:(1)未處理組,未給予刺激物；(2)對照組,用等量的BMP4溶解緩沖液處理PASMCs 60h；(3)BMP4組,用BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h。收

4、集細胞，用iQ SYBR Green supermix試劑實時定量細胞中的TRPC1,6 mRNA的表達；用Western Blotting檢測TRPC1,6 蛋白質(zhì)的表達。
　　 2、BMP4對Smad1/5/8，ERK1/2，p38MAPK 信號通路的影響：原代培養(yǎng)大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞，培養(yǎng)至第五天細胞密度達到80-90％,將細胞隨機分為七個組:(1) 對照組,用等量的BMP4溶解緩沖液處理PASMCs15min；(2)

5、BMP4(50ng/ml)處理組: 分別用BMP4(50ng/ml)處理PASMCs15min、30min、1h、4h、8h、60h。收集細胞，用Western Blotting檢測BMP4對Smad1/5/8，ERK1/2，p38MAPK 信號通路的影響。
　　 3、BMPRⅡSiRNA、SB及PD對BMP4/Smad1/5/8，ERK1/2，p38MAPK 信號通路的影響：用Western Blotting檢測BMPRⅡ-S

6、iRNA、PD和SB對BMP4刺激Smad1/5/8、ERK1/2和p38MAPK信號通路的影響。
　　 4、SB及PD對BMP4促進大鼠遠端PSMCs表達TPRC1,6mRNA和蛋白質(zhì)的干預(yù)作用：原代培養(yǎng)大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞，培養(yǎng)至第五天細胞密度達到80-90％,將細胞隨機分為四個組:(1) 空白對照組，細胞未給予任何刺激物；(2) DMS0對照組，DMSO預(yù)處理細胞30min，BMP4(50ng/ml)處理PASMCs6

7、0h；(3)SB組，SB(5μM)預(yù)處理細胞30min，BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h；(4)PD組，PD(10μM)預(yù)處理細胞30min，BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h；收集細胞，用iQ SYBR Green supermix試劑實時定量細胞中的TRPC1,6 mRNA的表達，用Western Blotting檢測TRPC1,6 蛋白質(zhì)的表達。
　　 5、SB或PD對 BMP4增加PSMCs

8、內(nèi)鈣離子濃度的影響的研究：原代培養(yǎng)大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞，培養(yǎng)至第三天細胞密度達到50％,將細胞隨機分為四個組：1) 空白對照組，細胞未給予任何刺激物；(2) DMS0對照組，DMSO預(yù)處理細胞30min，BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h；(3)SB組，SB(5μM)預(yù)處理細胞30min，BMP4(50ng/ml)處理PASMCs60h (4)PD組，PD(10μM)預(yù)處理細胞30min，BMP4(50ng/ml)處理

9、PASMCs60h。細胞用Fura-2孵育，使Fura-2進入細胞內(nèi)，用熒光顯微鏡檢測，根據(jù)標準曲線，推算細胞內(nèi)Ca2+濃度。
　　 三、慢性低氧對小鼠肺組織內(nèi)BMP內(nèi)源性拮抗蛋白表達的影響
　　 實驗選用雄性的BMP4基因敲除的同種系BMP4+/+C57BL/6J純合子小鼠和BMP4+/-C57BL/6J雜合子小鼠，將BMP4+/+C57BL/6J小鼠隨機分為5組（n=3或4）：即正常對照組、低氧1天組、低氧3天組、低

10、氧7天組和低氧21天組。6只BMP4+/-C57BL/6J小鼠隨機分成低氧1天和對照2組。將低氧小鼠置于低氧裝置內(nèi)，調(diào)節(jié)箱內(nèi)氧濃度為10％，每天24小時持續(xù)低氧。對照組小鼠除吸入空氣外，其它飼養(yǎng)條件與實驗組相同。低氧完成后，麻醉小鼠取出心肺組織，左肺儲存于-80。C冰箱備用，右肺組織提取總RNA；用實時定量PCR檢測BMP內(nèi)源性拮抗蛋白的mRNA表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 一、BMP4能夠增加大鼠遠端PASMCs內(nèi)鈣

11、離子濃度，未處理組、僅以溶解液處理對照組和50ng/ml BMP4處理組，[Ca2+]I分別為 204.07±1.22nM; 170.64±0.68nM; 415.52±3.94nM，實驗組PASMC內(nèi)鈣離子濃度明顯高于對照組，P值〈0.05。
　　 二、BMP4能夠促進大鼠遠端PASMCs的TRPC1、6mRNA及蛋白的表達，未處理組和對照組比較無差異表達，與對照組比較BMP4組TRPC1,TRPC6mRNA表達量明顯升高，分

12、別上升1.69倍，2.08倍（P〈0.05)，BMP4組與對照組相比,BMP4分別使TRPC1/β-actin,TRPC6/β-actin的蛋白灰度比值增加1.61倍,1.41倍（P〈0.05)，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 三、BMP4作用于大鼠遠端PASMCs,可以迅速激活Smad信號通路(15min),而后隨時間的延長逐漸減弱，也可以迅速激活P38MAPK及ERK1/2信號通路(15min),并且在作用4h時出現(xiàn)第二個激活高

13、峰。
　　 四、BMPRⅡsiRNA轉(zhuǎn)染大鼠遠端PASMCs,成功地沉默了BMPRⅡ蛋白表達的同時,減弱了BMP4對Smad磷酸化水平。
　　 五、P38MAPK信號通路的特異性抑制劑SB及ERK1/2信號通路的特異性抑制劑PD能夠降低BMP4刺激所引起的TRPC1、6mRNA的表達，用ERK1/2的抑制劑PD處理組TRPC1和TPC6mRNA的相對表達量分別降低1.6倍和1.7倍（P〈0.05)；用P38MAPK的抑制

14、劑SB處理組TRPC1和TPC6mRNA的相對表達量分別降低1.5。
　　 六、P38MAPK信號通路的特異性抑制劑SB及ERK1/2信號通路的特異性抑制劑PD能夠降低BMP4刺激所引起的TRPC1、6蛋白表達增加，SB+B4、PD+B4與DMSO+B4組比較TRPC1蛋白表達TRPC1/β-actin的灰度比值分別下降2.3倍（P〈0.05)；SB+B4、PD+B4與DMSO+B4組比較TRPC6蛋白表達TRPC6/β-act

15、in的灰度比值分別下降2.7倍（P〈0.05)。
　　 七、P38MAPK信號通路的特異性抑制劑SB及ERK1/2信號通路的特異性抑制劑PD均能夠降低BMP4對大鼠遠端PASMCs內(nèi)基礎(chǔ)Ca2+濃度增加的程度，用ERK1/2的抑制劑PD和P38MAPK的抑制劑SB處理的PASMCs內(nèi)這種BMP4誘導(dǎo)的Ca2+濃度增加分別降低1.9倍和1.6倍(P〈0.05)。
　　 八、在正常的BMP4+/+C57BL/6J小鼠肺組織中

16、至少存在8種BMP內(nèi)源性拮抗劑，分別是chordin、chordin-1、Noggin、Mgp、FSRP、CV-2、Fst和Gremlin。
　　 九、8種BMP內(nèi)源性拮抗蛋白的mRNA的表達隨小鼠缺氧的時間呈先上升后下降的趨勢，低氧第一天表達增加尤其明顯，其中FSN的表達趨勢較其他幾種BMP內(nèi)源性拮抗蛋白明顯,別增加3.64倍、1.23倍、2.0倍、2.0倍、1.9倍、2.8倍、1.4倍、28倍(P〈0.05)。
　　

17、 十、常氧狀態(tài)下，BMP4+/+C57BL/6J純合子小鼠和BMP4+/-C57BL/6J雜合子小鼠肺組織內(nèi)大多數(shù)BMP內(nèi)源性拮抗蛋白mRNA的表達無明顯差異，兩組對照，BMP4+/-雜合子小鼠肺組織內(nèi)Noggin和 CV2 mRNA的表達上升,分別為1.36倍、1.91倍(P〈0.05)，chordin mRNA的表達降低,下降0.59倍。
　　 結(jié)論：
　　 一、BMP4促進細胞內(nèi)Ca2+濃度增加是低氧性肺動脈高壓發(fā)

18、病機制中新的觀點。BMP4可以激活Smad、P38MAPK和ERK1/2信號通路。BMP4可以通過激活P38MAPK，ERK1/2途徑，刺激大鼠遠端PASMCs的TRPC1，6mRNA及蛋白的表達增加，通過TRPC1，6組成的Ca2+通道增加細胞內(nèi)的Ca2+濃度，從而增加血管的緊張度及促進血管平滑肌增殖，最終導(dǎo)致肺動脈高壓。
　　 二、低氧條件下，細胞首先表現(xiàn)出應(yīng)激反應(yīng)，增加BMP內(nèi)源性拮抗蛋白的表達，隨后出現(xiàn)與BMP不協(xié)調(diào)的表