胃癌RNF180啟動子區(qū)異常甲基化影響基因表達的研究.pdf

1、目的:表觀遺傳學改變包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA調(diào)控和染色質(zhì)重塑等，抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化導致基因失活是表觀遺傳變異的重要機制之一，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。抑癌基因P16、RASSF1A、Runx3、PCDH10、hMLH1等啟動子區(qū)高甲基化可通過沉默基因表達，參與胃癌發(fā)生發(fā)展。
　　環(huán)指蛋白(RNF)180啟動子區(qū)呈高DNA基化狀態(tài)，參與細胞凋亡、細胞周期調(diào)控及腫瘤侵襲與轉移，與胃癌、肝癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。

2、本組前期研究發(fā)現(xiàn)，RNF180啟動子區(qū)甲基化水平與萎縮性胃炎和胃癌發(fā)病風險密切相關，發(fā)現(xiàn)多個GA、GC相關高甲基化及超甲基化位點。研究證實基因啟動子區(qū)高甲基化是腫瘤抑制基因失活的重要機制，在某些情況下甚至是抑癌基因失活的唯一機制。然而，胃癌變過程中RNF180啟動子區(qū)甲基化對其基因表達的影響及其機制尚不明確。
　　本研究通過檢測RNF180基因在胃癌組織、癌旁組織mRNA表達和啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，分析RNF180基因表達、

3、啟動子區(qū)甲基化與臨床病理特征的關系。DNA甲基化具有可逆性，甲基轉移酶抑制劑可以逆轉抑癌基因的高甲基化狀態(tài)，使之重新表達，從而達到抑制腫瘤生長的目的。去甲基化藥物5-氮雜2’-脫氧胞苷(5-aza-2-deoxycyt idine)是目前最為常見的核苷類甲基轉移酶抑制劑，本研究通過體外5-Aza處理人胃癌細胞株AGS，觀察干預前后RNF180 mRNA表達、啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)變化，探討RNF180啟動子區(qū)異常甲基化對基因表達的影

4、響;進一步，通過體內(nèi)檢測甲基轉移酶DNMT1基因表達水平，分析其與RNF180啟動子CpG島甲基化狀態(tài)及基因表達的相關性，正向檢驗RNF180啟動子區(qū)異常甲基化對基因表達的影響。通過本研究，旨在明晰RNF180異常甲基化增加胃癌風險的可能分子機制，為其臨床應用于胃癌早期診斷提供有價值的實驗依據(jù)。
　　研究方法:選取80例來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院經(jīng)手術治療并病理組織學檢查明確診斷接受的胃癌患者癌灶(GC)、癌旁(AC)及遠端正常

5、(NOR)胃黏膜組織，以及胃癌細胞株AGS、MKN45、SGC-7901、BGC-823、MGC803、HGC27和胃永生化上皮細胞株GES-1。Real-time RT-PCR法檢測RNF180和DNMTs基因mRNA表達;Western Blot法檢測RNF180蛋白表達;亞硫酸鹽處理后，BGS測序法檢測RNF180啟動子區(qū)甲基水平。5Aza（5-aza-2-deoxycyt idine）去甲基化處理胃癌細胞后，檢測處理前后RNF1

6、80基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與mRNA表達。
　　結果:1、NOR→AC→GC，RNF180 mRNA表達逐漸降低，NOR(P=0.001)和AC(P=0.029)組顯著高于GC組。2、NOR→AC→GC，RNF180 AMR、HSC逐漸增高，NOR和AC組AMR顯著低于GC組(P＜0.05)，NOR和AC兩組間差異無統(tǒng)計學意義;各組間HSC差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。3、GC組RNF180 mRNA表達與AMR(r=-0.

7、238，p=0.033)和HSC(r=-0.291，p=0.009)間顯著負相關。以AMR=0.35為cut-off值，GC高甲基化組mRNA表達顯著低于低甲基化組(P＜0.05);M3+M7為差異表達顯著的高頻超高甲基化位點組合。4、以RNF180 AMR=0.35為臨界值，GC組RNF180高甲基化組DNMT1 mRNA表達顯著高于低甲基化組(P＜0.05)。5、去甲基化藥物5-Aza處理胃癌細胞AGS后，RNF180甲基化水平降低