胃癌RNF180啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化影響基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的:表觀遺傳學(xué)改變包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA調(diào)控和染色質(zhì)重塑等，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致基因失活是表觀遺傳變異的重要機(jī)制之一，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。抑癌基因P16、RASSF1A、Runx3、PCDH10、hMLH1等啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可通過(guò)沉默基因表達(dá)，參與胃癌發(fā)生發(fā)展。
　　環(huán)指蛋白(RNF)180啟動(dòng)子區(qū)呈高DNA基化狀態(tài)，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控及腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移，與胃癌、肝癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2、本組前期研究發(fā)現(xiàn)，RNF180啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與萎縮性胃炎和胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)GA、GC相關(guān)高甲基化及超甲基化位點(diǎn)。研究證實(shí)基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化是腫瘤抑制基因失活的重要機(jī)制，在某些情況下甚至是抑癌基因失活的唯一機(jī)制。然而，胃癌變過(guò)程中RNF180啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)其基因表達(dá)的影響及其機(jī)制尚不明確。
　　本研究通過(guò)檢測(cè)RNF180基因在胃癌組織、癌旁組織mRNA表達(dá)和啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)，分析RNF180基因表達(dá)、

3、啟動(dòng)子區(qū)甲基化與臨床病理特征的關(guān)系。DNA甲基化具有可逆性，甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以逆轉(zhuǎn)抑癌基因的高甲基化狀態(tài)，使之重新表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。去甲基化藥物5-氮雜2’-脫氧胞苷(5-aza-2-deoxycyt idine)是目前最為常見(jiàn)的核苷類甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，本研究通過(guò)體外5-Aza處理人胃癌細(xì)胞株AGS，觀察干預(yù)前后RNF180 mRNA表達(dá)、啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)變化，探討RNF180啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化對(duì)基因表達(dá)的影

4、響;進(jìn)一步，通過(guò)體內(nèi)檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1基因表達(dá)水平，分析其與RNF180啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)及基因表達(dá)的相關(guān)性，正向檢驗(yàn)RNF180啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響。通過(guò)本研究，旨在明晰RNF180異常甲基化增加胃癌風(fēng)險(xiǎn)的可能分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用于胃癌早期診斷提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:選取80例來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院經(jīng)手術(shù)治療并病理組織學(xué)檢查明確診斷接受的胃癌患者癌灶(GC)、癌旁(AC)及遠(yuǎn)端正常

5、(NOR)胃黏膜組織，以及胃癌細(xì)胞株AGS、MKN45、SGC-7901、BGC-823、MGC803、HGC27和胃永生化上皮細(xì)胞株GES-1。Real-time RT-PCR法檢測(cè)RNF180和DNMTs基因mRNA表達(dá);Western Blot法檢測(cè)RNF180蛋白表達(dá);亞硫酸鹽處理后，BGS測(cè)序法檢測(cè)RNF180啟動(dòng)子區(qū)甲基水平。5Aza（5-aza-2-deoxycyt idine）去甲基化處理胃癌細(xì)胞后，檢測(cè)處理前后RNF1

6、80基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:1、NOR→AC→GC，RNF180 mRNA表達(dá)逐漸降低，NOR(P=0.001)和AC(P=0.029)組顯著高于GC組。2、NOR→AC→GC，RNF180 AMR、HSC逐漸增高，NOR和AC組AMR顯著低于GC組(P＜0.05)，NOR和AC兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各組間HSC差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。3、GC組RNF180 mRNA表達(dá)與AMR(r=-0.

7、238，p=0.033)和HSC(r=-0.291，p=0.009)間顯著負(fù)相關(guān)。以AMR=0.35為cut-off值，GC高甲基化組mRNA表達(dá)顯著低于低甲基化組(P＜0.05);M3+M7為差異表達(dá)顯著的高頻超高甲基化位點(diǎn)組合。4、以RNF180 AMR=0.35為臨界值，GC組RNF180高甲基化組DNMT1 mRNA表達(dá)顯著高于低甲基化組(P＜0.05)。5、去甲基化藥物5-Aza處理胃癌細(xì)胞AGS后，RNF180甲基化水平降低