TFPI-2基因啟動子區(qū)異常甲基化與胰腺癌關(guān)系的研究.pdf

1、胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一,盡管最近的病理診斷、分子生物治療上有所發(fā)展,但總的階段生存率仍只有4％。盡管在一級預防、手術(shù)治療,放、化療聯(lián)合治療上做出了巨大努力,這些病人長時間的生存率未能得到本質(zhì)上的提高。和其他惡性腫瘤一樣,胰腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及到環(huán)境和遺傳等因素。在遺傳因素中,胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程與癌基因和抑癌基因密切相關(guān),癌基因和抑癌基因功能的改變在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。抑癌基因在控制細胞生長,增殖及分化過程中起著十分重

2、要的抑制作用,能潛在抑制腫瘤生長。如果抑癌基因的功能失活或出現(xiàn)基因缺失、突變等異常,就可能導致細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化進而導致腫瘤的發(fā)生。抑癌基因失活的原因可有基因缺失、點突變、低表達和高甲基化等。其中抑癌基因的甲基化改變而導致該基因失活機制的研究逐漸受到重視。
　　人TFPI-2最早是由Jandial和Horne發(fā)現(xiàn)于胎盤而命名為胎盤蛋白-5。后人對 TFPI-2基因的研究逐步深入,發(fā)現(xiàn)其不但具有廣泛的抑制蛋白酶的作用,還具有抑制腫瘤發(fā)

3、生發(fā)展的作用。在已有的研究中,TFPI-2基因被認為在肝癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、纖維肉瘤等多種惡性腫瘤中具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用,TFPI-2基因的缺失往往促進了腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。在另一方面,一些研究顯示,在腫瘤組織中TFPI-2基因缺失的原因可能與TFPI-2基因啟動子區(qū)高甲基化有關(guān)。據(jù)此,本研究以手術(shù)切除的胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺組織、胰腺癌Panc-1細胞株作為實驗對象,應用細胞培養(yǎng),逆轉(zhuǎn)錄-

4、多聚合酶鏈反應(RT-PCR),Western-blot和甲基化特異性PCR(MSP)等方法,研究胰腺癌及正常組織中TFPI-2基因甲基化狀態(tài)、胰腺癌Panc-1細胞在去甲基化藥物5-Aza-dC處理前后TFPI-2基因的mRNA及蛋白表達的變化。該實驗可見,TFPI-2基因表達的缺失與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的緊密相關(guān)性。進一步研究了TFPI-2基因表達的改變及其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的改變,以及TFPI-2基因甲基化狀態(tài)改變前后表達情況改變的機制

5、,為胰腺癌患者早期特異性診斷和預后判斷及去甲基化藥物干預治療提供客觀的觀察指標,并為開展胰腺癌的基因和分子治療提供實驗依據(jù)。本文從以下幾部分進行論述:
　　第一部分 胰腺癌組織與正常組織中TFPI-2基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究
　　目的:檢測胰腺癌組織TFPI-2(組織因子途徑抑制物-2)基因 CpG島甲基化的狀態(tài),并分析甲基化改變與胰腺癌的關(guān)系。
　　方法:應用甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)檢測45例胰腺癌組織

6、、相應癌旁組織、8例正常胰腺組織中TFPI-2基因的甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:胰腺癌組織中TFPI-2基因的甲基化陽性率為71.1%(32/45),明顯高于癌旁組織的31.1%(14/45)(P<0.01)。8例正常胰腺組織中均未發(fā)生甲基化。TFPI-2基因甲基化陽性率還與胰腺癌的臨床分期、組織分化程度、腫瘤直徑具有相關(guān)性(P<0.05)。
　　結(jié)論:TFPI-2基因在胰腺癌組織中出現(xiàn)異常甲基化,可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切

7、。
　　第二部分 去甲基化藥物5-Aza-dC處理前后胰腺癌Panc-1細胞TFPI-2基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及表達的研究
　　目的:探討甲基化酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷對胰腺癌細胞系Panc-1中抑癌基因組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)甲基化水平及基因表達的影響。
　　方法:用不同濃度5-Aza-dC處理胰腺癌細胞系Panc-1。用甲基化特異性PCR(MS-PCR),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-PCR)及蛋白印

8、跡實驗(Western blot)檢測藥物處理前后Panc-1細胞TFPI-2基因的甲基化狀態(tài),mRNA及蛋白表達的改變。
　　結(jié)果:MSP檢測Panc-1細胞TFPI-2基因藥物作用后異常甲基化得到逆轉(zhuǎn),RT-PCR檢測到不同濃度5-Aza-dC處理后TFPI-2基因mRNA重新表達,相對表達量分別為0.211±0.087,0.327±0.068,0.609±0.017,Western Blot檢測TFPI-2基因蛋白重新表達,