同型半胱氨酸經(jīng)DNMT1調(diào)控周期素ADNA甲基化致內(nèi)皮祖細(xì)胞功能受損作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究同型半胱氨酸致大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)損傷中細(xì)胞周期素A的作用及DNA甲基化調(diào)控的具體機(jī)制,以探索同型半胱氨酸致動脈粥樣硬化可能的治療靶點(diǎn)。
　　方法：本課題以大鼠血液中提取的內(nèi)皮祖細(xì)胞為研究對象,以熒光標(biāo)記的CD34和CD133抗體標(biāo)記細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞。不同濃度同型半胱氨酸(Hcy)進(jìn)行干預(yù),以Boyden小室法與貼壁法分別檢測細(xì)胞的遷移能力和粘附能力;MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖活性;熒光實時定量PCR技術(shù)和

2、Westernblotting分別檢測CyclinA、DNMT1、MBD和MeCP2在不同濃度Hcy組中的表達(dá)水平;巢式降落式甲基化特異性PCR(ntMS-PCR)檢測CyclinADNA甲基化水平;高效液相色譜法(HPLC)檢測細(xì)胞中SAM和SAH的含量。為了確定CyclinA在Hcy致EPCs損傷中的作用,分別構(gòu)建CyclinA的過表達(dá)載體和RNA沉默載體,檢測Hcy對EPCs增殖活性的影響;同時為了確定DNMT1在甲基化調(diào)控中的角

3、色,以RNA干擾技術(shù)沉默DNMT1的表達(dá)后,檢測CyclinADNA甲基化的改變。
　　結(jié)果：流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示:CD133的陽性率為:(20.40±6.92)％;CD34的陽性率為:(49.17±12.47)%。MTT結(jié)果顯示:Hcy可以明顯抑制細(xì)胞的生長,以500mmol/L濃度組最為明顯,差異有顯著性(P<0.05)。不同濃度Hcy干預(yù)后,細(xì)胞的粘附能力明顯降低,其中500mmol/L組與對照組比較下降了52%。遷移活性檢

4、測結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著Hcy濃度的增加,細(xì)胞的遷移活性隨之下降,拮抗劑組遷移活性升高,EPCs的遷移活性分別為(17.23±4.54)%,(11.93%±2.68)%,(9.67±2.08)%,(8.53±1.31)%,(6.1±2.15)%和(11.57±2.38)%。
　　熒光實時定量PCR結(jié)果顯示,各Hcy組中CyclinAmRNA表達(dá)水平隨Hcy濃度的增加而減少。與正常對照組比較,500μmol/LHcy組中CyclinAmRN

5、A表達(dá)水平下降了55.2%,差異有顯著性(P<0.05)。CyclinA蛋白表達(dá)與其mRNA表達(dá)水平相一致。同時利用CyclinA基因重組和RNA干擾技術(shù)確定了CyclinA是關(guān)鍵基因。
　　ntMS-PCR檢測結(jié)果顯示,隨著Hcy濃度的增加,CyclinA甲基化程度逐漸降低。500mmol/LHcy組中CyclinA甲基化水平與正常對照組比較降低了約15.4%(P<0.05);與500mmol/L相比,拮抗劑組中甲基化水平則升高

6、了8.2%。HPLC法檢測SAM和SAH濃度結(jié)果顯示,不同濃度Hcy作用72h后,與正常對照組相比,各Hcy組中SAM和SAH的濃度均下降(P<0.05,P<0.01);同時500mmol/L組中SAM/SAH的比值與正常對照組比較下降了49.9%(P<0.05);與500mmol/L組比較,拮抗劑組和AZC組中SAM/SAH的比值分別升高了1.51倍和1.89倍,差異有顯著性(P<0.05,P<0.01)。MBDmRNA和蛋白的表達(dá)隨

7、著Hcy濃度的升高而下降,MeCP2的表達(dá)則呈上升趨勢。Hcy可以很大程度上抑制DNMT1的表達(dá),與正常對照組相比,100mmol/L,200mmol/L,500mmol/L,拮抗劑組及AZC組中DNMT1mRNA表達(dá)量分別下降了45.6%,61.8%,65.5%,51.8%和63.2%,差異具有顯著性(P<0.05,P<0.01)。DNMT1RNA干擾后結(jié)果顯示,與正常組相比,500mmol/LHcy+干擾片段組中CyclinA甲基化