匹格列酮對(duì)高同型半胱氨酸環(huán)境下內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、越來越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)通過合成并分泌細(xì)胞因子來促進(jìn)血管新生和內(nèi)皮層的修復(fù)。其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和白介素8(IL-8)在EPCs通過旁分泌因子促進(jìn)血管新生和內(nèi)皮修復(fù)的作用中扮演著主要的角色。
　　 血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平升高作為缺血性心血管病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，參與缺血性心血管病發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)，其機(jī)制十分復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，Hcy損害外周血EPCs的數(shù)量和功能。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Hcy減少EPCs數(shù)

2、量并損害其增殖、遷移和黏附功能，且隨著Hcy濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，EPCs的數(shù)量減少和功能損害明顯加重。隨后的在體研究顯示高Hcy血癥患者外周血EPCs數(shù)量減少、功能減退。進(jìn)一步研究提示Hcy加速EPCs衰老，伴隨EPCs增殖和集落形成能力的損害。Hcy加速EPCs衰老可能跟EPCs端粒酶活性下降以及Akt磷酸化水平的下降有關(guān)。盡管高Hcy引起EPC增殖、遷移等功能受損，但是，Hcy是否影響EPCs的旁分泌功能目前并不清楚。因此，我們

3、擬進(jìn)一步觀察Hcy對(duì)EPCs旁分泌能力以及旁分泌細(xì)胞因子在體內(nèi)皮修復(fù)能力的影響。另外值得關(guān)注的是，Hcy影響EPCs功能損害的確切機(jī)制目前仍有待明確。
　　 作為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPART)激動(dòng)劑的一種，匹格列酮(pioglitazone，PIO)已被證明能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，遷移以及新生血管能力。研究發(fā)現(xiàn)，PIO可以抑制EPCs的凋亡并增加小鼠體內(nèi)的血管新生。PIO亦可以改善糖尿病和冠心病病人體內(nèi)的EPCs的遷移和粘

4、附能力。但是PIO對(duì)EPCs的治療作用是否包括改善其旁分泌能力目前還有待進(jìn)一步證實(shí)。
　　 因此，基于上述考慮，我們首先觀察Hcy對(duì)于EPCs旁分泌細(xì)胞因子VEGF和IL-8的影響，EPCs旁分泌能力在體內(nèi)對(duì)損傷內(nèi)皮層的影響；PIO能否改善Hcy環(huán)境下EPCs的旁分泌，粘附和遷移能力及機(jī)制；PIO對(duì)NADPH酶亞基蛋白表達(dá)的影響。以下分三部分對(duì)本研究的方法、結(jié)果及結(jié)論作一簡(jiǎn)述。
　　 1、同型半胱氨酸對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞旁分泌功

5、能的影響
　　 目的：探討Hcy體外干預(yù)EPCs對(duì)EPCs旁分泌功能的影響。
　　 方法：采用密度梯度離心法從健康人外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，接種于人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d后，采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)FITC-UEA-I及DiI-acLDL雙染色鑒定EPCs，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志(VEGFR-2，CD34，CD133)，進(jìn)一步鑒定EPCs。采用不合細(xì)胞因子的培養(yǎng)基EBM-2替代正常培養(yǎng)基培養(yǎng)EPCs24h

6、，通過real-timePCR法檢測(cè)EPCs細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子合成的變化，并采用ELISA法檢測(cè)條件培養(yǎng)基中VEGF和IL-8水平。加入不同濃度的Hcy(10,50100,200和500μmol/L)干預(yù)24h，觀察量效關(guān)系。此外，采用200μmol/L的Hcy分別干預(yù)不同時(shí)間(3，6，12，24和36h)，觀察時(shí)效關(guān)系。采用球囊損傷法建立大鼠頸動(dòng)脈損傷模型，雄性Sprague-Dawley大鼠在頸動(dòng)脈損傷后分別按如下分組進(jìn)行灌注：(1)正

7、常對(duì)照組；(2)頸動(dòng)脈損傷+單純培養(yǎng)液；(3)頸動(dòng)脈損傷+EPCs條件培養(yǎng)液；(4)頸動(dòng)脈損傷+Hcy干預(yù)后EPCs條件培養(yǎng)液。一周后觀察不同條件培養(yǎng)液對(duì)大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮修復(fù)的影響。
　　 結(jié)果：與正常培養(yǎng)基相比，在不含細(xì)胞因子及血清的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境中，EPCs大量合成VEGF和IL-8，而其他細(xì)胞因子如IGR，HGE，SDF-1，PDGF-BB和Tβ4的合成無明顯變化。ELISA法檢測(cè)EPCs條件培養(yǎng)基中VEGF，IL-8濃

8、度分別為260.54±32.09pg/ml/1×106EPCs，15724.54±1817.24pg/ml/1×106EPCs。高濃度Hcy抑制EPCs分泌VEGF和IL-8。200μmol/L濃度Hcy干預(yù)EPCs時(shí)間依賴性抑制VEGF和IL-8的分泌。EPCs條件培養(yǎng)基顯著促進(jìn)大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮層修復(fù)，體外受到Hcy干預(yù)的EPCs條件培養(yǎng)基的促內(nèi)皮修復(fù)能力受到抑制。
　　 結(jié)論：EPCs合成分泌以VEGF和IL-8為主，通過旁分

9、泌細(xì)胞因子可促進(jìn)大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮修復(fù)。Hcy顯著減少EPCs旁分泌VEGF和IL-8，并損害EPCs通過旁分泌功能修復(fù)損傷動(dòng)脈的作用。
　　 2、匹格列酮通過抑制PKC的表達(dá)和NADPH酶的活性逆轉(zhuǎn)同型半胱氨酸下調(diào)的內(nèi)皮祖細(xì)胞旁分泌，粘附和遷移功能
　　 目的：探討匹格列酮(PIO)對(duì)Hcy下調(diào)的EPCs旁分泌，粘附和遷移功能的作用以及相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：從健康人外周血分離、培養(yǎng)循環(huán)EPCs7d。EPCs條件培養(yǎng)

10、液(EPCs-derivedconditionedmedium，EPC-CM)是體外培養(yǎng)循環(huán)EPCs用不含血清的EBM-2培養(yǎng)24h后獲得。如前述，EPCs在Hcy環(huán)境下(200μmol/L)培養(yǎng)24h，并提前30min加入PIO(10μmol/L)共處理。采用ELISA和realtime-PCR分別檢測(cè)VEGF和IL-8在條件培養(yǎng)液中的濃度和細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)mRNA合成水平。Westernblot檢測(cè)Hcy對(duì)EPCs中的PKC磷酸化水平的影

11、響，并加入PIO和PKC抑制劑預(yù)處理30min，觀察PKC磷酸化的變化。細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)濃度通過在細(xì)胞內(nèi)裝載熒光探針H2DCF-DA后用流式細(xì)胞儀分析。NADPH酶活性采用以光澤精基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法。觀察預(yù)先加入PIO，NADPH抑制劑DPI和PKC抑制劑GF對(duì)Hcy誘導(dǎo)的EPCs內(nèi)ROS和NADPH酶活性的影響。對(duì)于GF和DPI預(yù)處理的Hcy共培養(yǎng)的EPCs，通過ELISA和realtime-PCR觀察抑制PKC和NAPDH酶

12、后對(duì)EPCs旁分泌的影響。采用粘附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)和millicell小室分別觀察PIO對(duì)Hcy誘導(dǎo)下的EPCs的粘附能力和遷移能力的影響。
　　 結(jié)果：PIO逆轉(zhuǎn)Hcy下調(diào)的VEGF和IL-8的mRNA合成和蛋白分泌水平。Westernblot提示Hcy能時(shí)間依賴性激活P-PKC，以PKCβII激活為主，而PIO能抑制PKC的磷酸化?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)法提示Hcy能時(shí)間依賴性激活NADPH酶，PIO，PKC抑制劑GF可以抑制NADPH酶

13、的激活。通過熒光探針檢測(cè)EPCs內(nèi)ROS，PIO，NADPH酶和PKC抑制劑減少Hcy上調(diào)的活性氧生成。PKC抑制劑和NADPH酶抑制劑逆轉(zhuǎn)Hcy下調(diào)的VEGF和IL-8水平。PIO可以改善Hcy誘導(dǎo)的EPCs的粘附遷移能力損傷。
　　 結(jié)論：PIO能顯著改善Hcy對(duì)EPCs的旁分泌，粘附和遷移功能的損害。PIO通過抑制PKC的激活和NADPH酶的活性逆轉(zhuǎn)Hcy所誘導(dǎo)的EPCs功能損傷。
　　 3、匹格列酮對(duì)同型半胱氨酸

14、干預(yù)下內(nèi)皮祖細(xì)胞NADPH酶的影響
　　 目的：探討PIO對(duì)Hey干預(yù)下EPCs的NADPH酶亞單位的影響。
　　 方法：從健康人外周血分離、培養(yǎng)循環(huán)EPCs。培養(yǎng)第七天，采用不同濃度的Hcy(10,50,100和200μmol/L)干預(yù)EPCs24h，Westernblot檢測(cè)NADPH酶亞單位p67和Nox2。分別預(yù)先加入PIO(10μmol/L)，NADPH酶抑制劑DPI和PKC抑制劑GF共培養(yǎng)，觀察PIO對(duì)Hcy

15、干預(yù)下NADPH酶亞單位表達(dá)的影響。采用p67-siRNA和Nox2-siRNA干擾NADPH酶相應(yīng)亞基蛋白合成，觀察亞基蛋白下調(diào)后對(duì)Hcy誘導(dǎo)的EPC旁分泌功能損傷的作用。采用ELISA和real-timePCR檢測(cè)VEGF和IL-8表達(dá)。采用粘附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)和millicell小室分別觀察下調(diào)p67或Nox2亞單位對(duì)Hcy誘導(dǎo)下的EPCs的粘附能力和遷移能力的影響。預(yù)先加入PPARγ受體特異性抑制劑GW9662以觀察PIO是否通過該

16、受體來拮抗Hcy的病理作用。
　　 結(jié)果：Hcy濃度依賴性增強(qiáng)NADPH亞單位p67和Nox2的表達(dá)。PIO抑制了Hcy上調(diào)的p67和Nox2蛋白的表達(dá)。NADPH酶抑制劑DPI和PKC抑制劑GF同樣也抑制了NADPH酶亞單位蛋白的上調(diào)。p67-siRNA和Nox2-siRNA轉(zhuǎn)染后顯著抑制p67和Nox2蛋白表達(dá)。單獨(dú)下調(diào)p67亞單位蛋白拮抗Hcy誘導(dǎo)的EPCs旁分泌因子減少，單獨(dú)下調(diào)Nox2亞單位蛋白統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異。下調(diào)

17、p67或Nox2蛋白表達(dá)都可以逆轉(zhuǎn)Hcy誘導(dǎo)的EPCs粘附能力和遷移能力損傷。我們使用了PPARγ抑制劑GW9662并發(fā)現(xiàn)其不能抑制匹格列酮帶來的有利效應(yīng)。
　　 結(jié)論：PIO能顯著改善Hcy誘導(dǎo)下EPCs中NADPH酶亞單位蛋白的上調(diào)，這種作用通過抑制PKC的激活獲得與NADPH酶抑制劑DPI相同的效果。轉(zhuǎn)染p67-siRNA后逆轉(zhuǎn)了Hcy誘導(dǎo)的EPCs旁分泌VEGF和IL-8的減少。單獨(dú)下調(diào)p67或Nox2亞基都可以拮抗Hc