植物青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因簇及相關(guān)基因功能研究.pdf

1、茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物細(xì)菌性青枯病是世界性重大病害。該菌具有較廣的寄主范圍和地理分布，由青枯菌引起的植物病害造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，人類已經(jīng)能夠從基因?qū)用嫫饰銮嗫菥闹虏C(jī)理，開(kāi)辟出有效控制青枯菌危害的新途徑和新方法，為生產(chǎn)上防治青枯菌奠定理論基礎(chǔ)。
　?、鲂头置谙到y(tǒng)(typeⅥ secretion system，T6SS)存在于各類細(xì)菌中，目前主要集中研究

2、人類和動(dòng)物致病菌中的Ⅵ型分泌系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)T6SS與病原菌的致病力、細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)及互作等多種生命活動(dòng)密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)T6SS核心基因參與了青枯菌的致病性。為深入探索T6SS在青枯菌中的功能，本文構(gòu)建了植物青枯菌Po82菌株的T6SS基因簇完全缺失菌株，從全局水平初步分析了T6SS的功能。
　　植物青枯菌基因組中存在兩個(gè)Ⅰ型信號(hào)肽酶，信號(hào)肽酶對(duì)青枯菌蛋白的分泌起著至關(guān)重要的作用，為了更好的研究Ⅰ型信號(hào)肽酶在植物病原菌中的作用

3、，探索青枯菌致病的分子機(jī)理，本文同時(shí)對(duì)青枯菌Po82菌株中兩個(gè)I型信號(hào)肽酶基因功能進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　1.基因缺失突變株和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，青枯菌 Po82菌株中的兩個(gè)Ⅰ型信號(hào)肽酶都有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中基因1716編碼蛋白具有信號(hào)肽和兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；而LepB蛋白可能具有跨膜結(jié)構(gòu)域，但不具有信號(hào)肽。通過(guò)同源重組雙交換，構(gòu)建基因缺失載體和互補(bǔ)載體，并篩選獲得T6SS基因簇和Ⅰ型信號(hào)肽酶單基因缺失突

4、變株，以及相應(yīng)的互補(bǔ)菌株。
　　2. T6SS基因簇的功能分析
　　在接種前期，突變株P(guān)o82ΔⅥ的致病力明顯減弱，后期致病能力逐漸恢復(fù)，與野生型菌株相比差異不顯著；突變株 Po82ΔⅥ的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率明顯減弱，生物膜形成能力沒(méi)有明顯差異，qRT-PCR分析鞭毛相關(guān)基因，突變株P(guān)o82ΔⅥ基因flhC、flhD和fnr的表達(dá)量明顯下調(diào)，fliA基因表達(dá)量明顯上調(diào)，運(yùn)動(dòng)能力顯著增強(qiáng)；qRT-PCR分析Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)子基因，與

5、野生型菌株相比，差異不顯著。雖然T6SS在青枯菌的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但 T6SS基因簇的缺失可能不影響Po82菌株的Ⅲ型效應(yīng)子基因的表達(dá)或影響很小。
　　3.Ⅰ型信號(hào)肽酶基因的功能分析
　　突變株 Po82Δ1716致病力明顯減弱，生長(zhǎng)速率、運(yùn)動(dòng)能力顯著降低；qRT-PCR分析鞭毛及T3SS相關(guān)基因表達(dá)情況，鞭毛基因flhC、flhD和fnr的表達(dá)量明顯下調(diào)，說(shuō)明1716基因正向調(diào)控鞭毛相關(guān)基因的表達(dá)；其Ⅲ型標(biāo)志效應(yīng)子