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文檔簡介
1、研究背景:
西洛他唑是1978年日本大冢制藥有限公司合成的抗血小板類化合物,1988年作為治療慢性動脈閉塞癥的藥物在日本上市。隨著大型循證醫(yī)學(xué)證實,西洛他唑可以顯著改善慢性動脈閉塞癥引起的下肢潰瘍、疼痛、發(fā)冷和間歇性跛行等缺血性癥狀,1999年美國FDA批準其作為治療穩(wěn)定性間歇性跛行的藥物上市[1]。成為美國市場上第一個獲得作為治療該適應(yīng)癥的抗血小板聚集的藥物;在臨床上還被應(yīng)用于治療糖尿病等引起的外周血管性疾病[2]。
2、r> 西洛他唑是一種選擇性磷酸二酯酶3抑制劑,可抑制血小板及平滑肌內(nèi)磷酸二酯酶的水解,增加細胞內(nèi)cAMP水平,具有抗血小板聚集及血管擴張作用。
近年來還發(fā)現(xiàn)西洛他唑有抗炎作用及抗平滑肌細胞增殖的作用,支架植入術(shù)后應(yīng)用西洛他唑可減少新生內(nèi)膜的增生和重構(gòu),有抗晚期血管再狹窄的作用[3-5]。這些效應(yīng)將作為西洛他唑抗血小板效應(yīng)的補充且使之成為缺血性疾病獨特的重要治療。
一、西洛他唑?qū)用}粥樣硬化中血管內(nèi)皮細胞
3、的作用
動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是常見的血管病變,是缺血性心腦血管疾病的常見原因,嚴重的危害著人類的健康。既往的觀點認為,AS是機體脂質(zhì)代謝障礙的結(jié)果,隨著研究的深入,目前大多數(shù)學(xué)者認為AS是血管炎癥性損傷的一種表現(xiàn),認為AS是血管內(nèi)皮細胞功能發(fā)生紊亂后的炎癥反應(yīng)及在此基礎(chǔ)上的損傷-修復(fù)過程[6]。血管內(nèi)皮細胞(VascularEndothelialCells,VEC)既是血管內(nèi)壁的一道機械屏障
4、,又是一個具有高度活性的、位于血液和組織分界內(nèi)表面的人體最大的內(nèi)分泌器官。它具有細胞通透性、選擇性屏障、止血、抗凝、纖溶、血液傳輸和血管活性物質(zhì)代謝及調(diào)節(jié)血管運動張力、產(chǎn)生生長因子、纖維基質(zhì)增生等作用,參與炎癥反應(yīng)[7],影響血管發(fā)生、血管通透性及液體平衡等。在動脈粥樣硬化早期階段,損傷部位活化的內(nèi)皮細胞會分泌黏附分子和化學(xué)趨化因子,如血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)和單核細胞趨化蛋白(MCP-1),導(dǎo)致免疫細胞和單核細胞聚集并遷移
5、到血管壁內(nèi)膜。VCAM-1在早期粥樣硬化斑塊形成時起主要作用,并且MCP-1是慢性炎癥反應(yīng)的媒介,二者可使單核細胞黏附。另外,活性氧與TNF-α也參與動脈粥樣硬化的形成。有研究[8]表明細胞核因子-κB(NF-κB)激活基因在人類動脈粥樣硬化的血管中表達增高。
作為一種新型的磷酸二酯酶3(PDE3)抑制劑,西洛他唑的基本作用是抗血小板聚集。它有許多額外的細胞作用靶點:可抑制PDE活性和阻礙環(huán)磷酸腺苷(cAMP)降解及轉(zhuǎn)化,
6、可預(yù)防動脈粥樣硬化和血栓形成及血管阻塞;減少黏附分子的表達(如VCAM-1),抑制細胞因子釋放和起效(如MCP-1、PDGF和TNF-α等),具有抗炎和抗動脈抗粥樣硬化的作用[9];此外,通過提高細胞內(nèi)cAMP水平擴張血管,促進血管內(nèi)皮恢復(fù)和抑制血管增生,提高組織灌注,對缺血性腦組織起神經(jīng)保護作用[10,11]。研究發(fā)現(xiàn)西洛他唑?qū)ρ軆?nèi)皮細胞有明顯的保護作用,MATSUMOTO等[12]的動物實驗表明西洛他唑能通過增加內(nèi)皮依賴性超極化因
7、子的反應(yīng)來改善2型糖尿病大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮細胞的功能。進一步的研究表明,西洛他唑可能通過ERK1/2和P38MAPK依賴途徑對抗由脂多糖介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡[13]。除此之外,西洛他唑還有抑制炎癥細胞對內(nèi)皮細胞的黏附作用及抑制內(nèi)皮細胞表達的作用,MORI等[14]發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)單核細胞cAMP的濃度,西洛他唑有抑制單核細胞對內(nèi)皮細胞黏附的作用。
二、西洛他唑?qū)ρ芷交〖毎淖饔?br> 血管平滑肌細胞(vascular
8、smoothmusclecells,VSMC)是血管壁的主要成分之一,是決定血管活性和血管構(gòu)型的重要因素。其增殖在動脈粥樣硬化、血管再狹窄和高血壓等多種血管性疾病的形成機制中起著重要作用。在參與AS形成的細胞體系中,其中VSMC是增殖體系中最活躍的細胞。臨床及實驗研究[15.16]均證實西洛他唑能夠抑制VSMC增殖及預(yù)防冠狀動脈介入治療術(shù)后血管再狹窄。西洛他唑可以抑制由不同的生長因子,包括血小板衍生因子(PDGF)胰島素和胰島素樣生長因
9、子-1誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)大鼠主動脈血管平滑肌細胞的增殖反應(yīng),也可抑制由PI3GF誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細胞的增殖反應(yīng)[17,18]。近年來的研究[19]還顯示,血漿PAI-1的水平與冠心病、內(nèi)膜增生和再狹窄密切相關(guān),而西洛他唑能通過各種機制包括下調(diào)TGF-B,JNK和P38信號途徑,抑制相關(guān)細胞因子的表達,從而起到抗血管平滑肌細胞增殖的作用。
三、西洛他唑?qū)z裂原活化蛋白激酶的作用
絲裂原活化蛋白激酶(mi
10、togen-activatedproteinkinase,MAPK)家族屬于高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,廣泛分布于真核生物胞漿中。MAPK信號通路是一條細胞外信號引發(fā)細胞核內(nèi)反應(yīng)的重要途徑,在細胞形成、分化、生長、增殖及凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[20]。目前發(fā)現(xiàn)MAPK家族有四條信號通路:即細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)、c-JunN端激酶(c-JunN-ter
11、minalkinase,JNK)、p38MAPK和ERK5/BMK1通路[21]。經(jīng)典的MAPK級聯(lián)反包括3個激活步驟:MAPK激酶激酶(mitogen-activatedproteinkinaseki-nasekinase,MAPKKK)激活后磷酸化并激活MAPK激酶(mitogen-activatedproteinkinasekinase,MAP-KK),接著MAPKK通過雙重磷酸化鄰近的蘇氨酸和酪氨酸而激活MAPK,激活后的MAP
12、K可由胞漿轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)作用于靶目標(biāo)。大量事實表明MAPK也是西洛他唑的作用靶點[22-24]。
研究目的:
西洛他唑目前在臨床上廣泛應(yīng)用于血管性疾病包括缺血性心腦血管疾病的一級和二級預(yù)防,也是抗血小板藥物治療的基礎(chǔ)。已有大量臨床研究證實,西洛他唑可減少與動脈粥樣硬化有關(guān)疾病的發(fā)生。血管內(nèi)皮細胞功能障礙和血管平滑肌細胞增殖在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究旨在分別觀察西洛他唑?qū)w外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞和
13、血管平滑肌細胞的增殖及磷酸化
P38MAPK絲裂原活化蛋白激酶表達的影響,以進一步從細胞和分子水平上闡述西洛他唑?qū)用}粥樣硬化血管的保護作用。
研究方法:
1.96孔板上體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EA.hy926,用終濃度為10、30、100、300umol/l的西洛他唑分別作用24小時并設(shè)立對照進行比較,采用MTT法確定細胞的增殖狀態(tài)。
2.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EA.hy9
14、26,用不同終濃度的西洛他唑(10、30、100、300umol/l)刺激24小時并設(shè)立對照組進行比較,裂解細胞提取蛋白,考馬斯亮藍G-250染色法測定總蛋白濃度,利用P38磷酸化抗MAPK抗體的蛋白免疫印記法測定磷酸化P38MAPK蛋白表達。
3.在96孔板上體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞VSMC,用終濃度為10、30、100、300umol/l的西洛他唑分別作用24小時并設(shè)立對照進行比較,采用CCK-8法確定細胞的
15、增殖狀態(tài)。
4.體外培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞VSMC,用不同終濃度的西洛他唑(10、30、100、300umol/l)刺激24小時并設(shè)立對照組進行比較,裂解細胞提取蛋白,考馬斯亮藍G-250染色法測定總蛋白濃度,利用P38磷酸化抗MAPK抗體的蛋白免疫印記法測定磷酸化P38MAPK蛋白表達。
研究結(jié)果:
1.采用MTT法確定人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的增殖狀態(tài):
各組細胞增殖率分別
16、為對照組0.909±0.012,CLZ10μmo/L組0.904±0.026;CLZ30μmol/L組0.851±0.023;CLZ100μmol/L組0.670±0.013;CLZ300μmol/L組0.651±0.036。統(tǒng)計分析顯示30μmol/L、100μmol/L和300μmol/L的CLZ分別能明顯抑制HUVECs的增殖(P<0.05),并呈劑量依賴性。
2.西洛他唑?qū)θ四氺o脈血管內(nèi)皮細胞中磷酸化P38MAPK
17、蛋白表達的影響:以對照組的密度掃描結(jié)果為100,10μmol/L西洛他唑?qū)α姿峄疨38MAPK蛋白沒有明顯的作用(96.3±6.0,P>0.05)。30μmol/L100μmol/L及300μmol/L的CLZ均能夠明顯抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表達(92.5±2.4,72.6±5.2,70.6±3.3,P<0.05)。
3.采用CCK-8法確定大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞的增殖狀態(tài):
各組細胞增殖率分別為
18、對照組0.835±0.022,CLZ10μmo/L組0.830±0.017;CLZ30μmol/L組0.796±0.022;CLZ100μmol/L組0.605±0.003;CLZ300μmol/L組0.581±0.032。統(tǒng)計分析顯示100μmol/L和300μmol/L的CLZ分別能明顯抑制大鼠血管平滑肌細胞的增殖(P<0.05)。
4.西洛他唑?qū)Υ笫笮刂鲃用}血管平滑肌細胞中磷酸化P38MAPK蛋白表達的
19、 影響:
以對照組的密度掃描結(jié)果為100,10μmol/L、30μmol/L的西洛他唑?qū)α姿峄疨38MAPK蛋白沒有明顯的作用(99.8±2.4,99.8±3.8,P>0.05)。100μmol/L及300μmol/L的CLZ均能夠明顯抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表達(86.7±1.6,77.9±2.3,P<0.05)。
研究結(jié)論:
本研究提示西洛他唑通過部分抑制血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞中
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