姜黃素和維甲酸抵制人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移行和重塑人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞外基質(zhì)的研究.pdf

1、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferativevitreoretinopathy，PVR)是在玻璃體和視網(wǎng)膜前后表面形成纖維增殖膜，由于膜的收縮和牽拉引起視網(wǎng)膜脫離(retinaldetachment，RD)為特征的一類眼病。PVR是孔源性視網(wǎng)膜脫離最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)展過(guò)程包括早期的細(xì)胞移行，細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和纖維細(xì)胞膜的形成和收縮，引起視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)明顯的變形，造成視網(wǎng)膜復(fù)位手術(shù)的失敗，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的視功能喪失或失明。

2、PVR也是嚴(yán)重眼外傷、血管性視網(wǎng)膜病變的常見并發(fā)癥。視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelium，RPE)細(xì)胞作為最關(guān)鍵細(xì)胞，貫穿于PVR發(fā)生、發(fā)展的所有過(guò)程。PVR病理上分為三個(gè)階段:第一階段RPE等細(xì)胞移行至視網(wǎng)膜前和視網(wǎng)膜下，開始增殖;第二階段包括RPE等細(xì)胞大量增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的重塑;最后階段纖維增殖膜形成并收縮導(dǎo)致RD。過(guò)多地纖維細(xì)胞膜的增殖被認(rèn)為是伴隨RPE細(xì)胞參與和細(xì)胞外基質(zhì)重塑的一種創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程。一旦

3、孔源性視網(wǎng)膜脫離中的RPE細(xì)胞從基底膜上播散下來(lái)，它的性質(zhì)就變得像體外培養(yǎng)的成纖維母細(xì)胞一樣活躍。
　　 臨床上一直沿用的治療PVR的方法是玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)，手術(shù)技術(shù)的飛速發(fā)展提高了視網(wǎng)膜復(fù)位率，但術(shù)后往往由于再次發(fā)生PVR，導(dǎo)致RD復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者視功能。因此，選擇安全有效的藥物早期防治PVR是一項(xiàng)既迫切又有廣泛前景的任務(wù)?，F(xiàn)在，無(wú)論在臨床上還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，藥物防治PVR日益成為研究的熱點(diǎn)。迄今為止眼科界所研究用于PVR的藥

4、物不下幾十種，這些藥物主要為西藥，雖然抗增殖作用強(qiáng)大，但作用單一，且可能存在一定細(xì)胞毒性，一直未能應(yīng)用于臨床。中藥具有藥源豐富、作用多樣且毒副作用小等眾多優(yōu)點(diǎn)，從理論上有很好的應(yīng)用前景。一種從植物中提取的天然中藥姜黃素進(jìn)入我們視線。姜黃素是從植物姜黃(Curcumalonga)中提取的一種天然有效成分。它具有抗癌性、抗炎性、抗血管化、抗氧化、抗風(fēng)濕和抗轉(zhuǎn)移等多種功效，在內(nèi)科及抗腫瘤疾病中研究頗多，但是在眼科領(lǐng)域國(guó)內(nèi)外報(bào)道為數(shù)不多。同時(shí)，

5、近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究多限于針對(duì)RPE細(xì)胞自身增殖的研究，對(duì)于RPE和其生物活性息息相關(guān)的微環(huán)境----細(xì)胞外基質(zhì)的相關(guān)特性目前還不十分明確或者報(bào)道的較片面。
　　 因此，本課題分別通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究姜黃素這種中藥對(duì)人砌）E細(xì)胞移行的抑制作用和對(duì)人RPE細(xì)胞外基質(zhì)的重塑的影響，并選取了先前研究中防治PVR效果顯著的藥物----維甲酸作為對(duì)照研究。積極從細(xì)胞外基質(zhì)方面，探討姜黃素和維甲酸這兩種藥物如何來(lái)阻止RPE細(xì)胞產(chǎn)生PVR的行為

6、，為PVR防治提供新思路。
　　 第一部分，姜黃素和維甲酸抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞移行的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:研究不同劑量的姜黃素和維甲酸對(duì)體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞移行的影響，評(píng)價(jià)姜黃素和維甲酸在人RPE細(xì)胞移行中的作用，并篩選出這兩種藥物抑制人RPE細(xì)胞移行的最佳藥物濃度。將最佳濃度的姜黃素和維甲酸分別作用于RPE細(xì)胞誘導(dǎo)的兔眼PVR模型，評(píng)價(jià)兩種藥物對(duì)RPE細(xì)胞在體內(nèi)侵襲能力的影響。
　　 方法:采用

7、胰蛋白酶消化法體外分離、培養(yǎng)人RPE細(xì)胞，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。取第4～6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RPE細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以MTT法檢測(cè)不同濃度姜黃素(0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10-5、2.0×10-5、4.0×10-5M)和不同濃度維甲酸(0、10-6、10-5、10-4、10-3M)作用48h后對(duì)人RPE細(xì)胞增殖的影響。通過(guò)計(jì)算48h作用時(shí)間后姜黃素和維甲酸的半數(shù)抑制率(thehalfmaximalinhib

8、itoryconcentration，IC50)。篩選合適濃度的姜黃素和維甲酸作用人RPE細(xì)胞，分別通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)，transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，3D膠原膠收縮實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)RPE細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)，探討姜黃素和維甲酸在人RPE細(xì)胞移行中的作用。
　　 結(jié)果:初分離的人RPE細(xì)胞呈球形，多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)中布滿黑色素顆粒，在培養(yǎng)48～72h內(nèi)貼壁，培養(yǎng)后7d細(xì)胞達(dá)融合，傳代細(xì)胞24h貼壁。傳至第4代細(xì)胞黑色素顆粒明顯減少，免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色法提

9、示細(xì)胞S-100抗原和角蛋白(cytokeratinAE1/AE3)抗原均表達(dá)陽(yáng)性。姜黃素和維甲酸的IC50分別是:1.2×10-5M和10-2.77M。
　　 劃痕實(shí)驗(yàn)中:0、10-6、10-5和10-4M的維甲酸和0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10-5M的姜黃素分別作用于人RPE細(xì)胞，維甲酸和姜黃素對(duì)細(xì)胞的遷移均有抑制作用，且呈濃度依賴性;transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中:0、10-6和10-5M的維甲酸

10、和0、0.25×10-5和0.5×10-5的姜黃素分別作用于人RPE細(xì)胞48h，維甲酸和姜黃素對(duì)細(xì)胞的侵襲均有抑制作用，且呈濃度依賴性;3D膠原膠收縮實(shí)驗(yàn)中:0、10-6和10-5M的維甲酸和0、0.25×10-5和0.5×10-5的姜黃素分別被加入含有2×105RPE的膠原膠的混合物中，連續(xù)觀察96h，維甲酸和姜黃素對(duì)膠原膠的收縮均有抑制作用，且呈濃度依賴性;RPE細(xì)胞體內(nèi)侵襲實(shí)驗(yàn)中:0、0.5×10-5M姜黃素和10-5M維甲酸各1

11、00μl和100μl含2×106第6代RPE混合液（共200μl）分別注入兔眼玻璃體腔，連續(xù)觀察4周。與對(duì)照組比較，姜黃素和維甲酸能顯著地抑制PVR的形成。
　　 結(jié)論:通過(guò)體外培養(yǎng)的方法可獲得大量人RPE細(xì)胞，用于體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究;結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、3D膠原膠的收縮模擬實(shí)驗(yàn)和RPE細(xì)胞體內(nèi)侵襲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，0.5×10-5M的姜黃素和10-5M的維甲酸對(duì)體外培養(yǎng)和注入兔眼內(nèi)的人RPE細(xì)胞的移行

12、能力有顯著地抑制作用，并且48h的時(shí)間觀察點(diǎn)被作為合適的實(shí)驗(yàn)條件確定下來(lái)，將應(yīng)用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
　　 第二部分，姜黃素和維甲酸對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞外基質(zhì)和粘附分子mRNA水平的影響
　　 目的:通過(guò)觀察姜黃素和維甲酸對(duì)體外和體內(nèi)人RPE細(xì)胞移行的影響，應(yīng)用基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR)檢測(cè)姜黃素和維甲酸對(duì)人RPE細(xì)胞外基質(zhì)和粘附分子mRNA表達(dá)的影響，探討姜黃素和維甲酸影響人RPE細(xì)胞

13、外基質(zhì)重塑的因素及作用機(jī)制。
　　 方法:選取第9代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人RPE細(xì)胞用于本研究。通過(guò)人的細(xì)胞外基質(zhì)和粘附分子PCR芯片技術(shù)描述0.5×10-5M的姜黃素和10-5M的維甲酸干預(yù)后人RPE(1×107)48h后細(xì)胞外基質(zhì)和粘附分子基因表達(dá)圖譜。并與不加任何藥物的空白對(duì)照組進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:與對(duì)照組比較，84個(gè)被檢測(cè)的基因中，與姜黃素相關(guān)的17個(gè)基因的mRNA顯著下調(diào)，10個(gè)顯著增加(P＜0.05);與維甲酸

14、相關(guān)的有24個(gè)基因，其中20個(gè)基因的mRNA顯著下調(diào)，4個(gè)顯著增加（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:姜黃素和維甲酸對(duì)人RPE細(xì)胞外基質(zhì)和粘附分子的mRNA的表達(dá)影響是顯著的，有選擇性的，并有類似的作用機(jī)制。這兩種藥物共同抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MatrixMetalloPreteinases，MMP)，如MMP1，MMP2，MMP9;大多數(shù)的膠原蛋白;纖粘連接蛋白1(Fibronectin1)和層粘連蛋白等;共同增強(qiáng)MMP3和一些整合

15、素的表達(dá)。相比較而言，在調(diào)節(jié)MMP3、MMP9和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TissueInhibitorofMetalloproteinase1，TIMP1)的mRNA表達(dá)上，姜黃素比維甲酸的作用更強(qiáng)，更系統(tǒng)化。
　　 第三部分，姜黃素和維甲酸對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞外基質(zhì)和粘附分子蛋白質(zhì)水平的影響
　　 目的:通過(guò)觀察姜黃素和維甲酸對(duì)體外和體內(nèi)人RPE細(xì)胞移行能力的影響和細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)，應(yīng)用weste

16、rnblotting測(cè)定姜黃素和維甲酸對(duì)人RPE細(xì)胞外基質(zhì)和粘附分子中部分相應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，探討姜黃素和維甲酸重塑人RPE細(xì)胞外基質(zhì)的影響因素及作用機(jī)制，探討蛋白質(zhì)與基因的表達(dá)是否一致。
　　 方法:選取第9代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人RPE細(xì)胞用于本研究。通過(guò)westernblotting描述0.5×10-5M的姜黃素和10-5M的維甲酸干預(yù)人RPE(1×107)48h后細(xì)胞外基質(zhì)和粘附分子蛋白質(zhì)的表達(dá)。并與不加任何藥物的空白對(duì)照組

17、進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:與對(duì)照組比較，0.5×10-5M的姜黃素顯著地抑制纖維粘連蛋白1，MMP1，MMP2和MMP9蛋白質(zhì)的表達(dá)，增強(qiáng)MMP3蛋白質(zhì)的表達(dá);而10-5M的維甲酸顯著地抑制纖維粘連蛋白1，MMP1，MMP2，MMP9，MMP14，整合素ITGAM和ITGB2，增強(qiáng)了MMP3和鈣粘連蛋白-E蛋白的表達(dá);姜黃素和維甲酸比較，姜黃素對(duì)MMP3蛋白質(zhì)表達(dá)的作用較強(qiáng)。
　　 結(jié)論:姜黃素和維甲酸對(duì)人RPE細(xì)胞外基質(zhì)

18、和粘附分子的蛋白質(zhì)表達(dá)影響是顯著的，有選擇性的，并有類似的作用機(jī)制。這兩種藥物共同抑制MMP1，MMP2，MMP9，纖粘連蛋白1(Fibronectin1)等;共同增強(qiáng)MMP3的表達(dá)。姜黃素和維甲酸對(duì)人RPE細(xì)胞外基質(zhì)和粘附分子蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)與對(duì)基因的調(diào)節(jié)是一致的。
　　 第四部分，姜黃素對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響
　　 目的:觀察人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化，探討不同濃度姜黃素干預(yù)后，在人視網(wǎng)膜

19、色素上皮細(xì)胞和其基質(zhì)間可能存在的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用機(jī)制。
　　 方法:對(duì)各組第6代人RPE細(xì)胞進(jìn)行5μMFluo-3負(fù)載30min，姜黃素分別以0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10-5、2.0×10-5、4.0×10-5M濃度干預(yù)人RPE細(xì)胞，利用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)測(cè)定各組RPE細(xì)胞內(nèi)早期鈣離子的熒光變化。
　　 結(jié)果:LSCM檢測(cè)結(jié)果:0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10

20、-5、2.0×10-5、4.0×10-5M姜黃素組RPE細(xì)胞內(nèi)均有鈣熒光?？瞻讓?duì)照組鈣熒光強(qiáng)度明顯低于姜黃素各組，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度與姜黃素的刺激濃度呈正相關(guān)（r=0.922，P＜0.05）。
　　 結(jié)論:體外培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞經(jīng)不同濃度姜黃素干預(yù)后，較空白對(duì)照組，早期細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度明顯增加。結(jié)合四部分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們推斷當(dāng)細(xì)胞受到姜黃素外界信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度能迅速增加，繼而傳遞信號(hào)，重塑細(xì)胞外基質(zhì)，引起細(xì)胞