缺血后處理減輕大鼠心肌缺血-再灌注損傷及其增強(qiáng)干細(xì)胞治療心肌梗死效果.pdf

1、目的：本研究旨在探討：(1)缺血后處理是否通過(guò)阻斷線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換減輕心肌細(xì)胞凋亡及超微結(jié)構(gòu)損傷；(2)在心肌梗死后、再灌注前，對(duì)遠(yuǎn)隔的另一心肌區(qū)域進(jìn)行短暫、反復(fù)非梗死性缺血，能否減輕缺血／再灌注損傷，及其可能機(jī)制；(3)缺血后處理減輕缺血／再灌注損傷、調(diào)控心肌微環(huán)境，能否進(jìn)而增強(qiáng)移植干細(xì)胞的存活及修復(fù)梗死心肌的能力，及其可能機(jī)制。 方法：(1) SD大鼠給予麻醉、開(kāi)胸，結(jié)扎左主冠狀動(dòng)脈(LCA)30min，之后持續(xù)再灌注5mi

2、n或120min，隨機(jī)分為8組(n=12)：假手術(shù)組，未予缺血；對(duì)照組，未予其它處理；缺血后處理組，于再灌注前給予3個(gè)循環(huán)的10秒再灌注及10秒缺血；缺血預(yù)處理組，于30min缺血前給予3個(gè)循環(huán)的5min缺血及5min再灌注；其余4組給予線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔阻斷劑環(huán)孢霉素A或開(kāi)放劑蒼術(shù)苷。TTC法檢測(cè)心肌梗死面積。電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。分光光度法檢測(cè)線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換。TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。(2)SD大鼠給予結(jié)扎LCA30min，之后持續(xù)再

3、灌注120min，隨機(jī)分為6組(n=8)：對(duì)照組；心臟內(nèi)遠(yuǎn)隔缺血后處理組，于開(kāi)放LCA前，對(duì)冠狀動(dòng)脈旋支進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的結(jié)扎10秒及開(kāi)放10秒；蒼術(shù)苷組，靜脈給予蒼術(shù)苷；心臟內(nèi)遠(yuǎn)隔缺血后處理+蒼術(shù)苷組：經(jīng)典缺血后處理組；假手術(shù)組。檢測(cè)心肌梗死面積、心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。血流動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)心臟功能，分光光度法檢測(cè)炎癥反應(yīng)。(3)貼壁培養(yǎng)法獲取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，使用攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒進(jìn)行標(biāo)記。SD大鼠給予結(jié)

4、扎LCA30min，之后持續(xù)再灌注72小時(shí)或28天，隨機(jī)分為5組(n=16)：對(duì)照組；缺血后處理組；單純干細(xì)胞移植組，于再灌注120min，經(jīng)心肌局部注射GFP標(biāo)記的BMSCs；缺血后處理+干細(xì)胞移植組；假手術(shù)組。移植70小時(shí)(再灌注72小時(shí))，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)及免疫組化法檢測(cè)炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β及抗炎因子IL-10表達(dá)；Western-blot及Real-time PCR法檢測(cè)抗凋亡因子

5、BCL-2及促凋亡因子BAX表達(dá)。移植70小時(shí)及28天，免疫熒光染色法檢測(cè)存活的GFP陽(yáng)性的BMSCs及其分化。移植28天，Real-time PCR及Westem-blot或免疫組化法檢測(cè)旁分泌因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)血管再生；Masson染色法檢測(cè)膠原沉積；超聲心動(dòng)圖法檢測(cè)心臟功能。 結(jié)

6、果：(1)與對(duì)照組比較，缺血后處理、環(huán)孢霉素A及缺血預(yù)處理組心肌梗死面積明顯縮小，代表線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換程度的540nm光密度值下降百分比明顯降低(20.2％±2.3％vs.12.1％±1.8％，11.2％±3.3％，12.1％±5.6％，P＜0.01)，線(xiàn)粒體評(píng)分更低(2.09±0.27 vs.1.27±0.27.0.97±0.26，1.28±0.32，P＜0.01)，細(xì)胞凋亡指數(shù)更小(34.9％±2.6％vs.17.5％±1.7％，1

7、7.6％±2.1％，17.2％±2.1％，P＜0.01)。蒼術(shù)苷能阻斷、而環(huán)孢霉素 A未能增強(qiáng)缺血后處理的心臟保護(hù)作用。(2)與對(duì)照組比較，持續(xù)再灌注結(jié)束時(shí)，心臟內(nèi)遠(yuǎn)隔缺血后處理組及經(jīng)典缺血后處理組心肌梗死面積縮小(49.1％±5.2％vs.32.0％±5.5％，26.4％±5.0％，P＜0.05)，左室±dP/dtmax增高(+dP/dtmax，5983±620mmHg/svs.6938±690mmHg/s，6897±810mmHg/

8、s，P＜0.05；-dP/dtmax，5408±655mmHg/s vs.6235±649mmHg/s，6139±620mmHg/s，P＜0.05)，超微結(jié)構(gòu)損傷減輕，血漿及缺血心肌組織丙二醛活性降低、超氧化物岐化酶活性增高，缺血心肌組織髓過(guò)氧化物酶活性降低。蒼術(shù)苷阻斷心臟內(nèi)遠(yuǎn)隔缺血后處理的心臟保護(hù)作用。(3)與對(duì)照組比較，再灌注早期(72小時(shí))，缺血后處理組、單純干細(xì)胞移植組及缺血后處理+干細(xì)胞移植組降低炎癥及促凋亡因子水平，增強(qiáng)抗炎

9、及抗凋亡因子表達(dá)，缺血后處理+干細(xì)胞移植組的有益作用強(qiáng)于單純干細(xì)胞移植組(P＜0.05)。缺血后處理+干細(xì)胞移植組無(wú)論是移植70小時(shí)還是28天，GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著高于單純干細(xì)胞移植組(移植70小時(shí)，90士14/mm2 vs。61±12/mm2，P＜0.01；移植28天，55±14/mm2 vs.26±8/mm2，P＜0.01)；沒(méi)有發(fā)現(xiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。移植28天，缺血后處理組、單純干細(xì)胞移植組及缺血后處理+干細(xì)胞移植組

10、心功能高于對(duì)照組(左室射血分?jǐn)?shù)，LVEF，69％±6％，75％±4％，82％±4％vs.62％±8％，P＜0.05)，缺血后處理+干細(xì)胞移植組與單純干細(xì)胞移植組之間LVEF存在差異(P＜0.05)。單純干細(xì)胞移植組及缺血后處理+干細(xì)胞移植組生長(zhǎng)因子表達(dá)、梗死區(qū)域毛細(xì)血管密度均高于對(duì)照組(P<0.01)，兩組之間也均存在差異(P<0.01)。相對(duì)于對(duì)照組，缺血后處理組、單純干細(xì)胞移植組及缺血后處理+干細(xì)胞移植組阻斷膠原沉積及MMP-9表達(dá)

11、，增強(qiáng)TIMP-1表達(dá)：缺血后處理+干細(xì)胞移植組的上述作用較缺血后處理組及單純干細(xì)胞移植組更強(qiáng)(P<0.05)。 結(jié)論：(1)阻斷線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換可能參與缺血后處理減輕心肌細(xì)胞凋亡及超微結(jié)構(gòu)損傷。(2)心臟內(nèi)遠(yuǎn)隔缺血后處理縮小心肌梗死面積，減輕缺血／再灌注損傷，阻斷線(xiàn)粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放可能參與這種心臟保護(hù)作用。(3)缺血后處理通過(guò)減輕缺血／再灌注損傷、調(diào)控心肌微環(huán)境，可以進(jìn)而增強(qiáng)移植干細(xì)胞的存活及修復(fù)梗死心肌的能力，旁分泌機(jī)