鴨疫里默氏桿菌莢膜多糖輸出蛋白基因的發(fā)現(xiàn)及其免疫原性研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌病是家鴨、火雞和多種其它鳥類的一種接觸傳染性疾病。該病呈世界范圍分布，已在幾乎所有的集約化養(yǎng)鴨生產(chǎn)的國家發(fā)現(xiàn)。該病的發(fā)病率和死亡率較高，已成為目前危害世界各國養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止，關(guān)于鴨疫里默氏桿菌的分子生物學(xué)研究資料較少，國內(nèi)外尚無關(guān)于血清1型RA基因文庫的研究報(bào)告。由于目前我國鴨疫里默氏桿菌病流行的血清型以1型出現(xiàn)頻率最高，因此我們以血清1型RA菌株為材料構(gòu)建基因文庫，以

2、期篩選出相應(yīng)的抗原基因，為RA基因工程疫苗研究奠定基礎(chǔ)，為該病的診斷與流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供高純度的特異性抗原。 本研究以血清1型RACH-1株為材料，酚氯仿抽提基因組DNA。采用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ進(jìn)行部分酶切消化，首先小量酶切優(yōu)化確定酶切時(shí)間和作用濃度，然后在小量酶切預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上擴(kuò)大反應(yīng)體系進(jìn)行酶切，采用試劑盒純化回收1.0kb-6.5kb片段，將其用T4DNA連接酶與經(jīng)BamHⅠ酶切并去磷酸化的ZAPExpress載體進(jìn)行連

3、接，用噬菌體包裝蛋白包裝。經(jīng)測(cè)定包裝滴度為5.23×106pfu/ml，藍(lán)白斑篩選重組率為96.8％，表明已成功構(gòu)建血清1型RA基因文庫。 在成功構(gòu)建RA基因文庫的基礎(chǔ)上，采用兔血清對(duì)文庫進(jìn)行免疫篩選，獲得了3個(gè)陽性斑，并對(duì)其中一個(gè)進(jìn)行了復(fù)篩及純化，對(duì)該陽性斑進(jìn)行體內(nèi)刪除，對(duì)獲得含插入片段的噬菌粒進(jìn)行酶切鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序，并將該序列遞交GenBank，獲得登錄號(hào)為DQ151838。 通過核酸序列相似性搜索比對(duì)、ORF分

4、析、基因預(yù)測(cè)，初步判定ORF1110讀框是一個(gè)完整的有意義ORF，是與莢膜多糖蛋白相關(guān)的基因；ORF1155讀框則與外膜蛋白相關(guān)，但起始密碼子上游未發(fā)現(xiàn)RBS(可能與起始密碼子上游序列長度太短有關(guān))，因此無法判斷是否是一個(gè)真正的ORF；而ORF2141讀框囿于序列長度只有起始密碼子而沒有終止密碼子，因此并不是一個(gè)完整的ORF，有必要通過試驗(yàn)來補(bǔ)齊這段序列再進(jìn)行分析；通過蛋白質(zhì)序列搜索比對(duì)、亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)、疏水性預(yù)測(cè)分析，進(jìn)一步證實(shí)O

5、RF1110與莢膜多糖生物合成密切相關(guān)，而ORF1155則與包括外膜蛋白、表面抗原的多個(gè)蛋白家族相關(guān)；采用軟件進(jìn)行抗原性預(yù)測(cè)分析表明ORF1110與ORF1155均存在多個(gè)抗原位點(diǎn)。 根據(jù)遞交的序列(GenBank登錄號(hào)為DQ151838)針對(duì)莢膜多糖輸出蛋白基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過對(duì)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了對(duì)血清1型RA進(jìn)行檢測(cè)的PCR方法。臨床檢測(cè)分析結(jié)果表明該方法具有特異性好、敏感高和易重復(fù)的特點(diǎn)，可初步作為檢測(cè)鴨疫里默

6、氏桿菌病的可靠方法。 由PCR獲得編碼RA莢膜多糖輸出蛋白的序列，測(cè)序鑒定后克隆到T載體，再雙酶切并連接入原核表達(dá)載體pET-32c(+)。表達(dá)質(zhì)粒pET32-CPEP轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析表明重組蛋白分子量為60kD。對(duì)重組表達(dá)蛋白進(jìn)行可溶性和不可溶性分析結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物主要以不溶性包涵體的形式存在。同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間及IPTG濃度進(jìn)行了優(yōu)化，確定了獲得最高表