HCV、HIV單一及合并感染者PBMC中APOBEC3G基因的表達(dá).pdf

1、研究背景：人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球性問(wèn)題，因兩者具有相同的傳播途徑，合并感染現(xiàn)象相當(dāng)常見(jiàn)，目前全球大約有4千萬(wàn)人感染HIV，其中超過(guò)1/3患者感染了HCV，在美國(guó)估計(jì)有30％的HIV感染者合并感染HCV，在西班牙，13萬(wàn)HIV感染者中至少50％感染者合并HCV感染，在我國(guó)經(jīng)血液感染HIV的患者合并HCV感染率達(dá)55.81％-90.36％。HIV、HCV合并感染加速了AIDS和肝損傷的進(jìn)展，具有協(xié)同致病

2、作用。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)的應(yīng)用已經(jīng)顯著降低了艾滋病患者的死亡率和機(jī)會(huì)性感染等合并癥的發(fā)生，但肝臟病變，尤其HCV合并感染導(dǎo)致的肝臟病變，成為了HIV/AIDS患者死亡的主要原因，所以對(duì)HIV/HCV合并感染者進(jìn)行抗丙型肝炎病毒治療成為近年來(lái)頗受關(guān)注的問(wèn)題。無(wú)論是HCV單一感染還是HIV/HCV合并感染，IFN-α都是抗HCV的首選藥物，但是因?yàn)镮FN-α在抗HCV的同時(shí)可以減少CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)，對(duì)于HIV/HCV合并

3、感染的治療方案和時(shí)機(jī)目前尚無(wú)確切定論。因此尋求新的具有抗病毒治療作用的分子一直是HIV、HCV和HIC/HCV合并感染領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文對(duì)HCV、HIV單一感染和HIV/HCV合并感染患者PBMC中APOBEC3G的表達(dá)水平進(jìn)行研究，并動(dòng)態(tài)觀察了IFN-α(聚乙二醇干擾素，Pega-IFN-α2a)治療對(duì)慢性丙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中APOBEC3G的表達(dá)水平的影響，以期為進(jìn)一步明確APOBEC3G在以上感染中的作用，

4、研究HCV、HIV單一感染及HIV/HCV合并感染時(shí)致病的分子機(jī)制，為尋求新的抗病毒治療方法提供依據(jù)。
　　 目的：基于APOBEC3G在抗病毒尤其抗HIV方面的重要作用，本研究初步探討HIV、HCV單一感染者及HIV/HCV合并感染者PBMC中APOBEC3G基因的表達(dá)，及HCV感染者APOBEC3G表達(dá)水平與病毒載量水平和干擾素治療的關(guān)系，對(duì)進(jìn)一步闡明APOBEC3G在以上感染中的作用和HCV、HIV及HIV/HCV合并感染

5、時(shí)致病的分子機(jī)制，尋求新的抗病毒治療方法具有較大的指導(dǎo)意義。本研究主要內(nèi)容：⑴HCV單一感染者(慢性丙型肝炎患者)PBMC中A3G mRNA及其蛋白的表達(dá)水平，A3G mRNA水平與HCV病毒載量的關(guān)系；HIV單一感染者和HIV/HCV合并感染者PBMC中A3G mRNA表達(dá)水平；⑵干擾素治療的不同時(shí)期，慢性丙肝患者PBMC中A3GmRNA的表達(dá)及與HCV病毒載量、血漿IFN-α變化的關(guān)系。
　　 方法：⑴76例慢性丙型肝炎患者

6、為在廣州市第八人民醫(yī)院感染科就診的病人，診斷符合2004年丙肝防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除其他病毒感染，包括甲型、乙型、戊型肝炎病毒和巨細(xì)胞病毒、EB病毒感染；排除自身免疫性肝炎、酒精性肝病和代謝性肝??；未使用過(guò)抗病毒藥物及免疫抑制劑；⑵18例HIV感染者為在廣州市第八人民醫(yī)院感染科就診的AIDS患者，均經(jīng)過(guò)CDC行HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性并PCR檢測(cè)病毒載量陽(yáng)性符合HIV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除其他病毒感染，包括甲型、乙型、丙型、戊型肝炎病毒和巨

7、細(xì)胞病毒、EB病毒感染；排除自身免疫性肝炎、酒精性肝病和代謝性肝病；未使用抗病毒藥物及免疫抑制劑；⑶28例HIV/HCV合并感染者均為在廣州市第八人民醫(yī)院感染科在住院病人，HIV感染經(jīng)CDC的HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性符合HIV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，HCV感染符合2004年丙肝防治指南的診斷標(biāo)病毒感染，排除甲型、乙型、戊型肝炎病毒感染；⑷20例慢性丙型肝炎患者，抗HCV治療方案為聚乙二醇干擾素(Pega-IFN-α2a，派羅欣)聯(lián)合利巴韋林治療一年

8、，收集系列血清及PBMC標(biāo)本；⑸嚴(yán)格按照入組標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)，收集標(biāo)本，各采集外周靜脈血15ml，分離血漿4ml(1ml/支)，-80。C凍存；PBMC5-9×107個(gè)(2.5-4.5×107個(gè)/支)，液氮凍存。⑹目的基因APOBEC3G和內(nèi)參基因18s rRNA引物及探針根據(jù)Yuichi Tanaka，et al，2006等的報(bào)道序列，分別選擇FAM和HEX進(jìn)行熒光標(biāo)記；⑺使用Trizol從PBMC提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，以

9、cDNA為模板，Real-time RCR檢測(cè)目的基因及內(nèi)參基因。⑻Western blotting方法測(cè)定PBMC中APOBEC3G蛋白表達(dá)量以GAPDH蛋白為內(nèi)參照，以小鼠抗人GAPDH單克隆抗體和小鼠抗人APOBEC3G多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG為二抗，化學(xué)發(fā)光法(ECL)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行顯色，并用Quantity One軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。⑻運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法測(cè)定外周血上清中HCV-RNA的含量。操作按說(shuō)明書(shū)

10、進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后結(jié)果由軟件自動(dòng)分析得出。⑼ELISA方法測(cè)定外周血上清中FN-α的含量，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品及樣本的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用Excel軟件計(jì)算樣本IFN-α含量(pg/ml)。⑽用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析(One way ANOVA)，多重比較采用LSD檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson積矩相關(guān)分析，P＜0.

11、05具有被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①慢性丙肝患者PBMC中A3G mRNA的表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照人群(P＜0.01)；血漿中的病毒載量與PBMC中A3G mRNA的表達(dá)水平無(wú)明顯相關(guān)性(R=0.092，P＞0.05)。②以GAPDH蛋白為內(nèi)參照，Western blotting檢測(cè)結(jié)果提示，與健康人相比較，慢性丙肝患者治療前PBMC中APOBEC3G蛋白表達(dá)水平有下調(diào)趨勢(shì)，但二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

12、③HIV單一感染及HIV/HCV合并感染患者PBMC中A3G mRNA的表達(dá)水平HIV單一感染組與健康對(duì)照組相比，A3G mRNA表達(dá)水平下調(diào)，p=0.001＜0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HIV/HCV合并感染組與健康對(duì)照組比較，A3G mRNA表達(dá)水平下調(diào)，p=0.030＜0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④HIV單一感染組、HIV/HCV合并感染組及HCV單一感染組三組比較，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=3.959，p=0.023＜0.05，三組之間差

13、別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在方差分析情況下進(jìn)行LSD兩兩比較檢驗(yàn)：HIV單一感染組與HCV單一感染組比較，p=0.766＞0.05，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HIV/HCV合并感染組較HIV單一感染組A3G mRNA表達(dá)水平增高，p=0.021＜0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HIV/HCV合并感染組較HCV單一感染組A3G mRNA表達(dá)水平增高，p=0.019＜0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤20例入組病例，療程結(jié)束后并繼續(xù)隨診，其中13例達(dá)到快速病毒學(xué)應(yīng)答

14、(RVR)，20例均達(dá)到早期病毒學(xué)應(yīng)答(EVR)和治療結(jié)束時(shí)病毒學(xué)應(yīng)答(ETVR)，其中11例達(dá)到持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)，另外9例患者治療結(jié)束尚未達(dá)到24周仍在隨診。⑥20例HCV感染者干擾素抗病毒治療0周、2周、4周、12周、24周、36周、48周等時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)A3G mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示治療后2周、4周與0周相比，A3G mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；治療后12周、24周、36周、48周和0周相比，A3

15、G mRNA表達(dá)水平均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，P值均＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在接受干擾素治療過(guò)程中，血漿病毒載量隨治療快速下降，至12W基本轉(zhuǎn)陰；血漿中IFN-α含量逐漸上升并維持在較高水平。
　　 結(jié)論：⑴HCV感染(慢性丙型肝炎)患者PBMC中APOBEC3G的表達(dá)水平明顯降低，但APOBEC3G的表達(dá)水平與HCV的復(fù)制水平無(wú)相關(guān)性。⑵HIV、HCV感染者PBMC中APOBEC3G的表達(dá)均降低，HCV感染導(dǎo)致APOBEC3G表