中藥組方“烏黃虎”合劑的研制及其毒理學(xué)研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌引起的一種呼吸系統(tǒng)疾病。該病具有高死亡，高傳染，各階段豬只均易感，常暴發(fā)流行等特點，臨床上經(jīng)常與多種病毒和細(xì)菌混合感染。該病臨床上表現(xiàn)為急、慢性肺部炎癥，引起呼吸系統(tǒng)功能障礙，最終導(dǎo)致死亡。目前臨床上治療豬傳染性胸膜肺炎主要以西藥為主，能起到很好的治療效果，但西藥在臨床上的濫用，不僅造成耐藥性、藥物殘留等問題，還可能在豬只生長過程中損害其臟器，影響生長發(fā)育。而中藥證明了具有經(jīng)濟(jì)、低毒、無殘留等優(yōu)點，故

2、本試驗從20味中藥中篩選出抗胸膜肺炎放線桿菌活性較強(qiáng)的幾味中藥，并進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗，篩選出有相加和協(xié)同作用的中藥組方并進(jìn)行毒理學(xué)評價，為新獸藥的研制提供理論和毒理學(xué)基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.20味中藥有效成分的提取及其抗胸膜肺炎放線桿菌活性研究:采用乙醇回流、水煎煮、超聲等方法對20味中藥進(jìn)行提取，將提取得到的中藥浸膏進(jìn)行體外抑菌試驗，測出各味中藥提取物抗胸膜肺炎放線桿菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibi

3、toryconcentration，MIC)和最小殺菌濃度（Minimal bactericidal concentration，MBC）。同時，采用棋盤法對篩選出抗胸膜肺炎放線桿菌效果較好中藥進(jìn)行聯(lián)合抑菌試驗。結(jié)果顯示:烏梅、黃連、訶子、秦皮、地榆、虎杖6種中藥提取物對胸膜肺炎放線桿菌的MIC范圍是6.25～50.00mg/mL;大青葉、茵陳、甘草和白鮮皮4種中藥提取物的MIC范圍是50.00～100.00mg/mL;黃柏、杜仲、金銀

4、花、柴胡、蒲公英、板藍(lán)根、梔子和黃芪等10種中藥提取物的MIC＞100mg/mL。聯(lián)合抑菌試驗結(jié)果表明:烏梅、黃連、訶子和虎杖兩兩聯(lián)合的抑菌指數(shù)（Fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）＜1，呈協(xié)同或相加作用;烏梅、虎杖分別與秦皮的FICI＞2，呈無關(guān)作用。通過試驗，對胸膜肺炎放線桿菌具有較好的體外抑菌效果的幾味中藥為:黃連、烏梅、虎杖、訶子、秦皮和地榆，同時烏梅、黃連、訶子和虎杖兩

5、兩聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同或相加作用，最終篩選出黃連、烏梅和虎杖三種中藥進(jìn)行組方。
　　2.中藥組方“烏黃虎”合劑中3味中藥最佳提取工藝的研究:對篩選得到抗胸膜肺炎放線桿菌效果較好且具有聯(lián)合作用的3種中藥黃連、烏梅和虎杖進(jìn)行最佳提取工藝研究，以浸膏得率、MIC和MBC之和作為評價指標(biāo)，優(yōu)選3味中藥最佳提取工藝。結(jié)果表明，黃連最佳提取工藝為:將黃連粉碎成粗粉，以70％乙醇濃度作為溶劑（料液比1∶8），加熱回流提取2次，每次2h;烏梅最佳提取工藝

6、為:將烏梅粉碎成粗粉，以95％乙醇作為溶劑（料液比1∶10），90℃加熱回流提取1次，每次8 h;虎杖最佳提取工藝為:將虎杖粉碎成粗粉，以60％乙醇作為溶劑（料液比1∶6），90℃加熱回流提取3次，每次2h。在最佳提取工藝下，黃連、烏梅和虎杖三種提取物浸膏對胸膜肺炎放線桿菌的MIC值分別為15.60 mg/mL、10.40 mg/mL、15.60 mg/mL，MBC值分別為26.00 mg/mL、18.20 mg/mL、15.60 mg

7、/mL，抑菌效果明顯，表明優(yōu)選得到的提取工藝穩(wěn)定可行。
　　3.中藥組方“烏黃虎”合劑的研制及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立:通過組方前的初步篩選，選出組方的溶劑，增溶劑，防腐劑等輔料，再通過輔料對“烏黃虎”合劑澄明度、相對密度等影響確定輔料用量，最終篩選出組方合劑制備工藝;利用薄層色譜對3味中藥原藥材、提取浸膏、“烏黃虎”合劑和合劑陰性對照進(jìn)行薄層色譜鑒定，確定原藥材、浸膏及合劑是否符合藥典規(guī)范;利用高效液相色譜分別對“烏黃虎”合劑中主藥烏梅和

8、虎杖主要成分枸櫞酸和虎杖苷進(jìn)行含量測定，建立系統(tǒng)的含量測定標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明:試驗篩選得到的合劑制備工藝可行，澄明度、相對密度等藥典規(guī)定項下檢測項目均符合要求;薄層色譜結(jié)果表明，3味中藥原材料和提取浸膏都符合藥典規(guī)定，在同一條件下與對照品出現(xiàn)相應(yīng)熒光斑點，“烏黃虎”合劑在3味中藥薄層色譜圖中與原材料和對照品出現(xiàn)相應(yīng)斑點;高效液相色譜結(jié)果表明，在色譜條件為乙腈-0.5％磷酸二氫銨溶液(3∶97)（以磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0）為流動相，檢測波長為

9、210nm，柱溫為25℃;流速為1.0 mL/min條件下，系統(tǒng)適應(yīng)性良好，在此條件下，枸櫞酸濃度在0.156 mg/mL～5.000 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，測定3批次“烏黃虎”合劑中枸櫞酸含量平均值為14.73 mg/mL;在色譜條件為乙腈-水溶液(23∶77)為流動相，檢測波長為306 nm，柱溫為25℃，流速為1.0 mL/min條件下，系統(tǒng)適應(yīng)性良好，在此條件下，虎杖苷濃度在6.25μg·mL-1～100.0

10、0μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，測定3批次“烏黃虎”合劑中虎杖苷含量平均值為1832.71μg·mL-1。結(jié)論:“烏黃虎”合劑制備工藝簡單可行;組方3味中藥原藥材、提取浸膏符合藥典規(guī)定;其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在規(guī)定的范圍內(nèi)可控。
　　4.中藥組方“烏黃虎”合劑的毒理學(xué)研究:根據(jù)獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編，毒理學(xué)評價包括對中藥組方“烏黃虎”合劑對大鼠灌胃急性毒性試驗和中藥組方合劑對大鼠灌胃30天亞慢性毒性試驗。急性毒性試驗表明，在

11、給藥劑量＞5000 mg/kg時，大鼠表現(xiàn)正常且無死亡，判定受試大鼠LD50＞5000 mg/kg，證明組方“烏黃虎”合劑為實際無毒物質(zhì)。亞慢性毒性試驗結(jié)果表明，“烏黃虎”合劑高劑量組(6.25 g/kg)、中劑量組(5.00 g/kg)、低劑量組(3.75 g/kg)大鼠連續(xù)30d灌胃給藥后，未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。試驗組大鼠采食、飲水等均正常。給藥后30d所測得大鼠的血液學(xué)指標(biāo)與正常組對照并無明顯差異，除低濃度劑量組“烏黃虎”合劑血液