對(duì)蝦WSSV和IHHNV病毒重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)快速檢測方法的研究.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）和傳染性皮下及造血組織壞死性病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)中最常見的兩種主要病原微生物，可分別引起對(duì)蝦白斑綜合征和慢性矮小短缺綜合癥（DRS)。這兩種病毒具有毒力強(qiáng)、復(fù)制快、傳播范圍廣、致死率高等特點(diǎn)。自上世紀(jì)八十年代以來，這兩種病毒性疾病的爆發(fā)，

2、給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對(duì)這兩種病毒性疾病的防治和控制還尚無有效藥物，唯一阻止其快速爆發(fā)的有效方法，就是在對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中實(shí)施早期診斷和提前預(yù)防的策略。
　　針對(duì)上述現(xiàn)狀，本文以WSSV和IHHNV兩種病毒為研究對(duì)象，旨在開發(fā)一套基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）快速檢測WSSV和IHHNV的診斷方法。同時(shí)，從穩(wěn)定性、重復(fù)性、靈敏度和檢測時(shí)

3、間等方面對(duì)該方法進(jìn)行系統(tǒng)分析，證實(shí)了其具有等溫、快速、便攜等特點(diǎn)，給對(duì)蝦樣品WSSV和IHHNV等病原微生物的原位檢測提供了技術(shù)支撐。本文研究結(jié)果主要包括：
　　（1）建立了一套針對(duì)對(duì)蝦樣品 WSSV病毒的實(shí)時(shí)、快速、等溫檢測方法。首先針對(duì)含有 WSS V保守 DN A片段（VP28）的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立一套R(shí)PA-WSSV標(biāo)準(zhǔn)檢測方法；然后采集不同養(yǎng)殖季節(jié)的對(duì)蝦樣本，提取其肝胰腺和肌肉組織的總DNA；利用RPA-WSSV方法對(duì)

4、蝦體中WSSV基因組進(jìn)行檢測，同時(shí)與qPCR（Mendoza-Cano F等人構(gòu)建）檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，RPA-WSSV方法在7min內(nèi)39℃條件下，可以快速檢測出蝦體中WSSV病毒DNA，其靈敏度達(dá)到10個(gè)分子，表明WSSV-RPA檢測體系是一個(gè)靈敏度高、特異性強(qiáng)和可靠性好的分子診斷方法。
　?。?）建立了一套針對(duì)對(duì)蝦樣品 IHHNV病毒實(shí)時(shí)、快速、等溫的檢測方法。首先針對(duì)含有 IHHN V基因組保守 DN A片段的重組

5、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立一套R(shí)PA-WSSV標(biāo)準(zhǔn)檢測方法；同樣采集不同養(yǎng)殖季節(jié)的對(duì)蝦樣本，提取其肝胰腺和肌肉組織的總DN A；利用RPA-I HHN V方法對(duì)蝦體中 IH HN V基因組進(jìn)行檢測，同時(shí)以O(shè)IE公布的標(biāo)準(zhǔn)qPCR檢測方法作為對(duì)照。結(jié)果顯示RPA-IHHNV方法同樣可以在39℃條件下，7分鐘以內(nèi)，對(duì)蝦體中IHHNV病毒DNA進(jìn)行快速檢測，其靈敏度達(dá)到4個(gè)分子，進(jìn)一步表明WSSV-IHHNV檢測體系是一個(gè)靈敏度高、特異性強(qiáng)和可靠性好的

6、分子診斷方法。
　?。?）RPA引物和探針的設(shè)計(jì)是目前該方法成功的關(guān)鍵和瓶頸。本研究通過設(shè)計(jì)多組 RPA引物和探針，結(jié)合引物優(yōu)化和篩選實(shí)驗(yàn)，較為系統(tǒng)地分析了RPA引物和探針的設(shè)計(jì)原則和相關(guān)機(jī)制。具體包括：在5’端3-5個(gè)堿基處，最好是嘧啶堿基（T/C），不要出現(xiàn)G，嘧啶堿基利于引物與重組酶形成引物-重組酶復(fù)合體，提高擴(kuò)增效率；3’端最好是堿基G或者C，這樣引物與模板之間結(jié)合更加穩(wěn)定；結(jié)合同一條模板的引物與探針之間應(yīng)相差少量堿基，不