mir-125a通過(guò)上調(diào)野生型P53促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡.pdf

1、microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小RNAs，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，miRNA通過(guò)降解目的mRNA或抑制其翻譯調(diào)控基因表達(dá)，參與調(diào)控多種生物學(xué)功能。研究表明有些miRNAs通過(guò)調(diào)控與細(xì)胞凋亡、增殖和侵襲相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)因子，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)mir-125a在乳腺癌和肺癌細(xì)胞中低表達(dá)，但其是否參與調(diào)控肺癌細(xì)胞凋亡、增殖和侵襲等生物學(xué)功能目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究mir-125a對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡、增殖和

2、侵襲的作用及其可能的機(jī)制。 材料與方法： 1、細(xì)胞系 人支氣管上皮細(xì)胞HBE，肺腺癌細(xì)胞A549、SPC-A-1和LTEP-a-2，肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1和QG56，人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞BE1，大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCL-H661和NCL-H460，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCL-H446。 2、miRNA序列 正義mir-125a序列：5'-UCC CUG AGA CCC UUU AAC CUG UG-3'；

3、 反義mir-125a序列：5'-CAC AGG UUAAAG GGU CUC AGG GA-3'；亂序miRNA序列：5'-GGA CGG CGA UCA GAU AAG AGU UC-3'。每個(gè)堿基都進(jìn)行了2'-O甲基化修飾以保持RNA序列的穩(wěn)定性，無(wú)熒光標(biāo)記。 3、細(xì)胞培養(yǎng) 10％或15％胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)，37℃、5％CO2。 4、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time P

4、CR) 提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)：TaqMan(R) MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒和TaqMan(R) MicroRNA Assays HSA-MIR-125A說(shuō)明書在Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System操作．以U18為對(duì)照，所有反應(yīng)均設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用RQ Manager 1.2分析。 5、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

5、 培養(yǎng)細(xì)胞至亞融合狀態(tài)，將正義mir-125a、反義mir-125a和亂序miRNA溶液(20μM)和Lipofectamine TM 2000混合液加入到孔板中。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4～6小時(shí)后換液．根據(jù)需要培養(yǎng)24到72小時(shí)。 6、流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC雙染法) 每種細(xì)胞分成四個(gè)小組：空白對(duì)照組、加AnnexinV組、加FITC組和加AnnexinV+FITC組。在BD FACSCalib

6、ur TM Flow Cytometer上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 7、Western Blot 采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。ECL顯色。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)采集，進(jìn)行灰度值測(cè)定，以β-actin為內(nèi)對(duì)照。 8、Transwell侵襲小室 轉(zhuǎn)染24h后，在上室加入100μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的細(xì)胞(2.5×105個(gè)/mL)(6h前鋪膠)，下室加入600μl含血清的培養(yǎng)基，37℃、5％C

7、O2條件下培養(yǎng)。24h后蘇木素染色，鏡下觀察、計(jì)數(shù)。 9、噻唑蘭(MTT)法 連續(xù)檢測(cè)5天，6個(gè)復(fù)孔。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔在490nm處的吸光值，根據(jù)吸光值繪制細(xì)胞增殖曲線。 10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用mean±SD表示， P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、9種不同類型肺癌細(xì)胞中僅SK-MES-1中mir-125

8、a的表達(dá)高于HBE細(xì)胞（P=0.008)，其余均低于HBE細(xì)胞，其中A549、NCL-H661、NCL-H460和SPC-A-1降低比較明顯(p<0.01)。 2、轉(zhuǎn)染正義mir-125a的A549細(xì)胞中成熟mir-125a表達(dá)明顯高于未處理組細(xì)胞(P=0.004)；轉(zhuǎn)染反義mir-125a的A549細(xì)胞中成熟mir-125a表達(dá)明顯低于未處理組細(xì)胞(P=0.005)。 3、轉(zhuǎn)染正義mir-125a能促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡

9、、抑制其侵襲；轉(zhuǎn)染反義mir-125a能抑制A549細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)其侵襲能力；正義和反義mir-125a對(duì)A549細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。 4、轉(zhuǎn)染正義mir-125a的A549細(xì)胞野生型P53表達(dá)約是未處理組細(xì)胞的7倍，轉(zhuǎn)染反義mir-125a的A549細(xì)胞野生型P53表達(dá)比未處理組細(xì)胞低40％。轉(zhuǎn)染正義mir-125a的A549細(xì)胞經(jīng)野生型P53抗體封閉后，細(xì)胞早期凋亡率明顯低于單純轉(zhuǎn)染組，約下降50％；但仍高于未處理組。這一