咖啡因?qū)53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)影響的機(jī)理研究.pdf

1、研究背景：
　　 膀胱癌是人類的多發(fā)病和常見病，全世界范圍內(nèi)膀胱癌發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)。流行病學(xué)的研究提示膀胱癌的發(fā)生受到很多環(huán)境因素的影響，其中就包括通過(guò)飲用咖啡等途徑對(duì)咖啡因的攝入，過(guò)量攝入咖啡因可增加發(fā)生膀胱癌的危險(xiǎn)性。但咖啡因又是世界范圍內(nèi)消耗最大、應(yīng)用最廣泛的一種神經(jīng)刺激物，由于人口基數(shù)很大，如果咖啡因確實(shí)能引起膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展，那么對(duì)整個(gè)人群健康就會(huì)產(chǎn)生重大的影響。因此，對(duì)咖啡因與膀胱癌之間究竟是何關(guān)系及可能的影

2、響機(jī)制進(jìn)行深入的研究就顯得十分的必要。
　　 第一部分研究咖啡因(caffeine)對(duì)p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響
　　 研究目的：
　　 應(yīng)用MTT及流式細(xì)胞技術(shù)，觀察咖啡因(caffeine)、離子射線(IR)和兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生的反應(yīng)，以了解咖啡因?qū)Π螂装┘?xì)胞凋亡的影響。
　　 材料和方法：
　　 1.RT4膀胱癌細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　 2.細(xì)胞分組

3、及處理。
　　 3.單純IR對(duì)RT4膀胱癌細(xì)胞增殖活性的影響(MTT法)。
　　 4.IR聯(lián)合咖啡因?qū)T4膀胱癌細(xì)胞增殖活性的影響(MTT法)。
　　 5.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.IR促進(jìn)了體外培養(yǎng)的RT4膀胱癌細(xì)胞株的凋亡。
　　 2.咖啡因能降低IR對(duì)RT4膀胱癌細(xì)胞的殺傷作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.I

4、R照射RT4膀胱癌細(xì)胞后，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡，并具有時(shí)間和劑量依賴模式。
　　 2.IR和咖啡因共同處理后，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡，也并具有時(shí)間和劑量依賴模式。
　　 3.加入濃度為1mM的咖啡因后，受不同放射劑量作用的RT4膀胱癌細(xì)胞的凋亡數(shù)量均有明顯的下降，表明1mM濃度的咖啡因?qū)T4膀胱癌細(xì)胞株有放射保護(hù)作用。
　　 第二部分研究咖啡因(caffeine)對(duì)p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞周期的影響
　　 研究目的：

5、
　　 通過(guò)對(duì)咖啡因(caffeine)、離子射線(IR)和兩者聯(lián)合處理過(guò)的p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，以了解咖啡因?qū)53(+)的RT4膀胱癌細(xì)胞周期的影響。
　　 材料和方法：
　　 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞周期的細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 1.IR照射可引起G0/G1和G2/M細(xì)胞期的阻滯，其中以G2/M期阻滯更加明顯。
　　 2.1mM咖啡因也可引起細(xì)胞周期G0/

6、G1和G2/M的阻滯，也對(duì)G2/M的阻滯更加明顯。
　　 3.咖啡因降低了IR對(duì)膀胱癌RT4細(xì)胞周期阻滯的影響，使細(xì)胞快速通過(guò)G0/G1，卻在G2/M期的阻滯增加。
　　 結(jié)論：
　　 RT4膀胱癌細(xì)胞受照射后發(fā)生G0/G1和G2/M細(xì)胞周期阻滯的出現(xiàn)和消退與放射敏感性可能有一定的關(guān)系，咖啡因通過(guò)增加RT4細(xì)胞在G2/M期的阻滯，降低了RT4細(xì)胞的凋亡，呈現(xiàn)出放射保護(hù)作用。
　　 第三部分探討咖啡因(ca

7、ffeine)影響p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞的DNA損傷反應(yīng)機(jī)制
　　 研究目的：
　　 檢測(cè)經(jīng)咖啡因(caffeine)、離子射線(IR)和兩者聯(lián)合處理過(guò)的p53野生型RT4膀胱癌細(xì)胞的γH2AX，ATM，ATR，pATM，Chk1，Chk2，p-Chk2，p53，p-p53，p21，PUMA，F(xiàn)AS等一系列DNA損傷反應(yīng)物質(zhì)，來(lái)探討咖啡因?qū)T4膀胱癌細(xì)胞影響的可能機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　

8、1.免疫熒光法檢測(cè)γH2AXfoci的數(shù)量和密度。
　　 2.RealtimePCR檢測(cè)p53及其靶基因的表達(dá)。
　　 3.Westernblotting檢測(cè)p53，p-p53，ATM，p-ATM，ATR，Chk2，p-Chk2，γH2AX，PUMA，p21和CaSpase-3等的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.咖啡因通過(guò)抑制上游調(diào)節(jié)物來(lái)抑制γH2AX。
　　 2.咖啡因抑制了p53以及其靶基因的

9、表達(dá)。
　　 3.咖啡因降低了IR對(duì)RT4膀胱癌細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 1.IR可能通過(guò)ATM-Chk2-p53-Puma信號(hào)軸對(duì)RT4細(xì)胞起到殺傷作用。
　　 2.咖啡因通過(guò)抑制ATM和ATR等DNA損傷-反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)等上游調(diào)節(jié)物來(lái)抑制γH2AX的表達(dá)。
　　 3.咖啡因抑制了TP53，p21，PUMA，F(xiàn)AS等p53下游靶基因的表達(dá)。
　　 4.啡因可能通過(guò)抑制RT4膀胱癌細(xì)胞的

10、DNA損傷反應(yīng)信號(hào)通路來(lái)降低IR對(duì)它的殺傷作用，咖啡因?qū)T4膀胱癌細(xì)胞起到了放射保護(hù)的作用。
　　 第四部分咖啡因(caffeine)對(duì)RT4膀胱癌在裸鼠體內(nèi)影響的研究
　　 研究目的：
　　 利用體外培養(yǎng)的RT4膀胱癌細(xì)胞株接種裸鼠，制造出荷瘤的裸鼠動(dòng)物模型，然后用離子射線(IR)來(lái)照射用咖啡因處理過(guò)的實(shí)體瘤，來(lái)驗(yàn)證咖啡因是否會(huì)增加RT4膀胱癌細(xì)胞的放射敏感性及其可能的機(jī)制。
　　 材料和方法：

11、>　　 1.RT4膀胱癌細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　 2.RT4膀胱癌細(xì)胞的復(fù)蘇和凍存。
　　 3.建立RT4膀胱癌細(xì)胞株的裸鼠模型。
　　 4.實(shí)驗(yàn)分組及處理。
　　 5.免疫組化分析檢測(cè)γH2AX和p-ATM的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT4膀胱癌細(xì)胞株荷瘤裸鼠動(dòng)物模型的成功建立。
　　 2.咖啡因降低了正常裸鼠膀胱粘膜細(xì)胞在IR后的凋亡。
　　 3.咖啡因降低RT4膀胱

12、癌細(xì)胞對(duì)IR的敏感性，減少了IR后γH2AX形成。
　　 4.咖啡因降低了IR對(duì)RT4膀胱癌細(xì)胞的影響，降低了IR后pATM的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.用培養(yǎng)的RT4膀胱癌細(xì)胞株能建立良好的荷瘤裸鼠動(dòng)物模型。
　　 2.1mM濃度的咖啡因能降低IR引起的膀胱癌細(xì)胞株實(shí)體瘤的凋亡。
　　 3.1mM濃度咖啡因可能通過(guò)抑制了ATM-Chk2-P53-Puma的途徑以及激活了其他DNA損傷反應(yīng)途徑