Hsa-miR-125a通過野生型p53與Bcl-w促進肺癌細胞凋亡.pdf

1、MicroRNA（miRNA）是一類長度約為21～24個核苷酸的非編碼小分子RNA。miRNA通過完全互補或部分互補方式識別靶基因3’-UTR，直接降解靶mRNA或抑制其翻譯，而抑制靶基因表達，調控細胞凋亡、增殖和分化。因此，miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。
　　 miR-125a是miRNA家族成員之一，存在前體和成熟體兩種形式，其成熟體具有生物學活性。目前發(fā)現(xiàn)其有兩種成熟體miR-125a-3p與miR-125

2、a-5p。
　　 本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)miR-125a-3p/5p在肺癌細胞中與HBE相比呈低表達，轉染正義miR-125a-3p/5p能使肺癌A549細胞內miR-125a-3p/5p含量增加，促進A549細胞凋亡，同時野生型p53表達也隨之升高，而轉染反義miR-125a-3p/5p則與之相反，但其調控機制尚不清楚。因此，我們認為miR-125a-3p/5p可能通過調控野生型p53促進A549細胞凋亡。
　　 利用多

3、種預測軟件通過對miR-125a-3p/5p可能作用的靶基因進行預測發(fā)現(xiàn)，能抑制p53的癌基因MDM2可能是miR-125a-3p/5p的共同靶基因； Bcl-w基因可能是miR-125a-3p/5p共同靶基因、Bcl-2基因可能僅是miR-125a-5p靶基因。p53是目前研究比較深入的促凋亡因子；Bcl-w、Bcl-2是Bcl-2家族成員，二者均為凋亡抑制因子。因此，我們推測miR-125a-3p/5p可能是通過MDM2/p53、B

4、cl-w、Bcl-2途徑調控肺癌細胞凋亡。本實驗將通過轉染正義或反義miR-125a-3p/5p增加或下調其在細胞內水平，研究其對肺癌細胞表達MDM2/p53、Bcl-w、Bcl-2影響，進一步揭示其調控凋亡的分子機制，為治療肺癌提供新的途徑。
　　 1、材料與試劑：
　　 材料與方法：人肺腺癌細胞A549、H1299（p53陰性）。
　　 成熟miR-125a序列：
　　 正義miR-125a-3p：5

5、’-ACA GGU GAG GUU CUU GGG AGC C-3’；
　　 反義miR-125a-3p：5’-GGC UCC CAA GAA CCU CAC CUG U-3’；
　　 亂序miR-1：5’-GGU CGG UGC UCG AUG CAG GUA A-3’；
　　 正義miR-125a-5p：5’-UCC CUG AGA CCC UUU AAC CUG UG-3’：
　　 反義miR-12

6、5a-5p：5’-CAC AGG UUA AAG GGU CUC AGG GA-3’；
　　 亂序miR-2：5’-GGA CGG CGA UCA GAU AAG AGU UC-3’；
　　 每個堿基都進行了2’-0甲基化修飾以保持RNA序列的穩(wěn)定性，無熒光標記。
　　 2、實驗方法：
　　 2.1 細胞培養(yǎng)：10％胎牛血清的DMEM（Gibco，USA）和RPMI-1640（Gibco，USA）培養(yǎng)，3

7、7℃、5％的CO2。
　　 2.2 Real time PCR：提取細胞總RNA，根據(jù)TaqMan（R）MicroRNA Reverse Transcription Kit（P/N：4366596，Applied Biosystems）試劑盒和TaqMan（）MicroRNA Assays HAS-MIR-125A（P/N：4380904，Applied Biosystems）按說明書操作。所有反應均設置三個復孔。
　　

8、 2.3 瞬時轉染：培養(yǎng)細胞至亞融合狀態(tài)，轉染正義或反義miR-125a-3p/5p和亂序組miR-1/2溶液（20uM）LipofectamineTM 2000混合液加入到孔板中。37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)4-6小時后將培養(yǎng)基換液，根據(jù)需要培養(yǎng)24-72小時。
　　 2.4 RT-PCR：提取細胞總RNA，按RT-PCR（TaKaRa）試劑盒方法進行反應。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

9、
　　 2.5 Western Blot：采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，ECL顯色。Western Blot實驗結果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)采集，進行灰度值測定，β-actin為內對照，重復三次。
　　 2.6 流式細胞術（Annetin V-FITC雙染法）：每種細胞轉染后分成四組：空白對照組、加Annetin V組、加FITC組和加Annetin V+FITC組。在BD FACSCaliburTMFlow Cytometer（

10、BD Biosciences）上檢測細胞凋亡情況。
　　 3、統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，對細胞實驗結果采用t檢驗進行數(shù)據(jù)分析，用mean±SD表示，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1、轉染正義或反義miR-125a-3p/5p對A549細胞中miR-125a-3p/5p表達水平和凋亡影響
　　 在A549細胞中分別轉染正義或反義miR-125a-3p/5p

11、，用亂序組和空轉染組作對照，轉染24h后，用Real-time PCR方法檢測miR-125a-3p/5p表達水平、用流式細胞術檢測細胞凋亡。結果顯示：轉染正義miR-125a-3p/5p組細胞中miR-125a-3p/5p表達水平和細胞凋亡率均比亂序組和空轉染組明顯增高（P<0.01）；轉染反義miR-125a-3p/5p組細胞中miR-125a-3p/5p表達水平和細胞凋亡率均比亂序組和空轉染組明顯降低（P<0.01）；亂序組和空轉

12、組與未處理組相比，miR-125a-3p/5p表達水平和細胞凋亡率均無明顯變化（P>0.05）。
　　 2、正義或反義miR-125a-3p/5p對A549細胞表達MDM2、野生型p53、Bcl-w和Bcl-2的影響
　　 在A549細胞中分別轉染正義或反義miR-125a-3p/5p 24h后，通過RT-PCR和Western Blot方法檢測MDM2、野生型p53、Bcl-w和Bcl-2等mRNA和蛋白表達情況。結果

13、顯示：正義miR-125a-3p/5p組細胞中p53 mRNA和蛋白表達升高，Bcl-w mRNA和蛋白表達降低，MDM2 mRNA無變化而蛋白表達降低，Bcl-2 mRNA和蛋白無變化；轉染反義miR-125a-3p/5p組細胞中p53 mRNA和蛋白表達降低，Bcl-w mRNA和蛋白表達升高，MDM2 mRNA無變化而蛋白表達升高，Bcl-2 mRNA和蛋白無變化。
　　 上述結果提示：miR-125a-3p/5p可能通過

14、抑制MDM2表達進而上調p53表達，促進細胞凋亡；或同時抑制Bcl-w表達促進細胞凋亡。
　　 3、阻斷p53或Bcl-w后，miR-125a-3p/5p對A549細胞凋亡影響
　　 為了明確miR-125a-3p/5p是否通過p53和/或Bcl-w途徑調控細胞凋亡，在轉染正義miR-125a-3p/5p同時用單克隆抗體封閉野生型p5324h；在轉染反義miR-125a-3p/5p同時用單克隆抗體封閉Bcl-w 24h，

15、用流式細胞術檢測細胞凋亡。結果顯示：正義miR-125a-3p/5p引起的細胞凋亡通過阻斷p53后受到不同程度的抑制（P<0.05），其中阻斷p53對正義miR-125a-5p引起的細胞凋亡抑制作用比miR-125a-3p顯著（P<0.05）；轉染反義miR-125a-3p/5p引起的細胞凋亡抑制通過阻斷Bcl-w后有不同程度恢復（P<0.05），其中阻斷Bcl-w對反義miR-125a-3p的作用比對反義miR-125a-5p的作用顯

16、著（P<0.05）。
　　 為了進一步明確野生型p53和Bcl-W在miR-125a-3p/5p誘導A549細胞凋亡中所起的作用是否不同，我們選擇p53陰性肺癌細胞系H1299，轉染正義和反義miR-125a-3p/5p 24h，用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果顯示：正義miR-125a-3p比正義miR-125a-5p引起的細胞凋亡顯著增高（P<0.01）；反義miR-125a-3p比反義miR-125a-5p抑制細胞凋亡顯

17、著降低（P<0.05）。
　　 上述結果表明：miR-125a-5p可能主要通過調控MDM2/p53途徑促進細胞凋亡，而miR-125a-3p可能主要通過調控Bcl-w途徑促進細胞凋亡。
　　 結論
　　 1、miR-125a-3p/5p可以通過抑制MDM2，上調野生型p53表達；同時抑制Bcl-w表達，促進肺癌細胞凋亡。
　　 2、miR-125a-5p可能主要通過調控MDM2/野生型p53途徑促進肺癌