蘭州地區(qū)急性呼吸道感染患兒HRV-HEV的臨床和分子流行病學研究.pdf

1、目的：應用實時熒光定量PCR及RT-PCR方法對蘭州地區(qū)急性呼吸道感染患兒的鼻咽抽吸物進行HRV/HEV的檢測及分型，初步掌握HRV/HEV在蘭州地區(qū)急性呼吸道感染兒童中的流行特征；探討不同HRV/HEV基因型與兒童急性呼吸道感染疾病嚴重程度的關系，掌握其流行特點及規(guī)律，揭示和闡明了蘭州地區(qū)兒童急性呼吸道感染的病因構成及HRV/HEV臨床及流行病學特點，并運用單引物擴增技術DNaseISISPA-PCR擴增獲得了5株蘭州鼻病毒C群的全基

2、因組，為蘭州地區(qū)兒童呼吸道感染的防治及進一步的研究奠定了基礎。
　　 研究對象及方法：
　　 1.收集蘭州地區(qū)2007年12月至2009年11月間，蘭州大學第一醫(yī)院兒科因急性呼吸道感染而就診或住院的兒童(年齡＜18歲)的鼻咽抽吸物(NPAs)和咽拭子標本共計772份，其中2007年12月-2008年11月255份，2008年12月-2009年11月517份。
　　 2.收集鼻咽抽吸物和咽拭子標本在登記相關標本采集

3、表后，低溫運送至中國CDC病毒所。呼吸道標本經(jīng)提取核酸后通過Real-time RT-PCR檢測HRV/HEV。同時每份標本采用PCR及RT-PCR方法檢測了HRSV、IFV(A和B型)、PIV(1、2、3)、HMPV、HCoV(HKU1和NL63型)、AdV、HBoV、WUPyV、KIPyV，并進行了序列測定。隨機選取一例HRV陽性標本的Real-time RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)體外轉錄成RNA標準品，梯度稀釋后用以對HRV核酸濃度進行定

4、量。使用基于5-UTR普通RT-PCR和VP4/VP2基因連接區(qū)的巢式RT-PCR兩個區(qū)段，對Real-time RT-PCR陽性標本進行擴增，并對擴增產(chǎn)物進行測序，所得測序結果與美國國立生物技術中心(NCBI)Genebank中的序列進行BLAST比較分析。采用MEGA4.0軟件對序列進行分析，并繪制系統(tǒng)進化樹。
　　 3.選取蘭州大學第一醫(yī)院兒科因急性呼吸道感染而就診或住院的，經(jīng)熒光定量PCR和普通RT-PCR檢測并分型為

5、鼻病毒C群的陽性的兒童的鼻咽抽吸物標本，經(jīng)美國國立生物技術中心(NCBI)Genebank中進行BLAST比較分析及MEGA4.0軟件對序列進行分析，并繪制系統(tǒng)進化樹后，選取與Genebank中的已發(fā)表的病毒株進化關系較遠的毒株進行Dnase I-SISPA-PCR擴增，大量隨機挑取克隆，并測序后，獲得病毒的全基因組。
　　 結果：在連續(xù)收集的兩年的鼻咽抽吸物標本中，共檢出HRV/HEV陽性標本205例，總檢出率為26.55％

6、。其中HRV檢出192例，檢出率為24.87％(192/772)；HEV檢出13例，檢出率為1.68％(13/772)。在HRV陽性的192例陽性標本中，HRV A型共發(fā)現(xiàn)112例，檢出率為14.6％(112/772)占所有HRV陽性標本的58.3％；HRV B型，14例檢出率為1.8％(14/772)占所有HRV陽性標本的7.29％；HRV C型，66例，檢出率為8.5％(66/772)，占所有HRV陽性標本的34.4％。其中，男性患

7、兒的檢出率為27.2％(133/488)，女性患兒的檢出率為25.4％(72/284)，男女感染率之比為1.85：1，男女的感染率無性別差異(P=0.564＞0.05)。感染患兒的年齡在6天-13歲10月之間，中位年齡為10月。其中1歲以內患兒115人，檢出率為30.1％(115/382)；1-3歲患兒50人，檢出率為16.9％(50/295)；3-5歲的患兒27人，檢出率為22.5％(27/120)；大于5歲的患兒13人，檢出率為17

8、.3％(13/75)，分別占了HRV/HEV感染人數(shù)的56.1％，24.4％，13.2％和6.3％。HRV/HEV感染患兒最多的診斷為急性支氣管肺炎、急性喘息性支氣管肺炎、上呼吸道感染和急性支氣管炎。在檢測的所有陽性標本中36.6％(75/205)的HRV/HEV感染患兒為單獨感染；63.4％(130/205)的HRV/HEV感染患兒為混合感染，男女的混合感染率比較無統(tǒng)計學差異(P=0.92＞0.05)。在混合感染的RNA病毒中，43.

9、1％(56/130)的患兒混合感染人合胞病毒(HRSV)；31.5％(41/130)的患兒混合感染人流感病毒病毒A型(IFV A)；27.7％(36/130)的患兒混合感染人副流感病毒3型(PIV3)；19.2％(25/130)的患兒混合感染人流感病毒B型(IFV B)；0.3％(4/130)的患兒混合感染的人冠狀病毒NL63型(HcoV-NL63)；0.2％(4/130)的患兒混合人副流感病毒2型(PIV2)；0.2％(3/130)的

10、患兒混合感染感染人偏肺病毒(hMPV)，在混合感染的DNA病毒方面，13.9％(18/130)的患兒混合感染人博卡病毒(HBoV)：8.5％(11/130)的患兒混合感染人多瘤病毒W(wǎng)U型(WUPyV)；8.5％(11/130)的患兒混合感染人多瘤病毒KI型(KIPyV)；0.4％(5/130)的患兒混合感染人腺病毒(AdV)。人合胞病毒(HRSV)、人流感病毒(IFV)、人副流感病毒(PIV)和人博卡病毒(HBoV)為最常見的混合感染病

11、毒。在合并的細菌感染方面，117分陽性標本做了細菌培養(yǎng)鑒定，其中70例為正常菌群或無菌生長；47例合并有細菌感染，最常見的合并感染的病原菌為肺炎克雷伯桿菌9例；大腸桿菌7例；肺炎鏈球菌7例；金黃色葡萄球菌7例；流感嗜血桿菌5例；副流感嗜血桿菌4例；陰溝桿菌3例。5’-UTR區(qū)段和VP4/VP2基因進化分析發(fā)現(xiàn)，所有的標本均能很好的分型，分別為HRV A、HRV B、HRV C和HEV。對HRV A與HRV C組間臨床癥狀進行比較，差別無

12、統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論:
　　 1.HRV/HEV的檢出率較高，在兒童呼吸道感染中占有重要地位，是繼呼吸道合胞病毒病毒后的第二位致小兒呼吸道感染的病毒性致病原。
　　 2.在臨床特點方面的比較HRV C感染與HRV A感染，無明顯差別。
　　 3.在蘭州地區(qū)擴增獲得的5株鼻病毒C群的全基因組，其中有4株與已有的HRV C全基因組的核苷酸同源性，可認為是HRVC的亞型。