與耐貯性相關(guān)的水稻脂氧合酶同工酶分析、OsLOX3的基因克隆以及一個脂氧合酶基因簇的結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、糧食安全是一個全球性的戰(zhàn)略問題，而糧食貯備是其中重要的一環(huán)。已經(jīng)知道，稻谷在一般貯藏條件下第二年就會產(chǎn)生陳化變質(zhì)現(xiàn)象，隨著貯藏過程中溫度和濕度的提高，陳化過程也會迅速加快。據(jù)統(tǒng)計，每年我國因為陳化問題損失的包括作為食用和種子的稻谷占總產(chǎn)量的3％。近年來的研究表明，稻谷貯藏期間脂質(zhì)的降解是導(dǎo)致其品質(zhì)下降并產(chǎn)生令人不快氣味的主要原因之一，其中脂氧合酶(lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12)是脂質(zhì)降解的關(guān)鍵酶。因此從理論

2、上講，糧食作物LOX的缺失可以明顯的阻止脂質(zhì)過氧化作用，減緩貯藏糧食氧化變質(zhì)的速度，保持清新氣味，提高耐貯性，上述推測已經(jīng)在水稻LOX的主要同工酶LOX-3的缺失體與耐貯性關(guān)系的研究中得到了初步證實，但是有關(guān)LOX-3缺失體的簡單篩選方法、水稻種子LOX同工酶分析、LOX-3的基因克隆以及與缺失的關(guān)系還有待于進一步的研究。 本文首先根據(jù)水稻種胚脂氧合酶-3共氧化的次生反應(yīng)特性及其催化產(chǎn)物的氧化特性，分別建立了篩選水稻種胚LOX-

3、3缺失體的胡蘿卜素漂白比色法和I2-KI，與常用的LOX-3單克隆抗體篩選技術(shù)相比，這兩種方法具有準確、快速、簡單且成本低的特點，可以進一步用于耐儲藏水稻的分子育種研究。 采用生物化學的手段發(fā)現(xiàn)，水稻種子發(fā)育過程中的LOX同工酶多態(tài)性是非常豐富的，其中存在有分子量明顯小于68 kDa的LOX同工酶。根據(jù)不同的分離方法，水稻種子發(fā)育過程中的LOX同工酶至少是4-9條。與具有LOX-3活性的越光相比，采用梯度PAGE(5-20％)分

4、析發(fā)現(xiàn)，LOX-3缺少品種Daw Dam的LOX缺少譜帶分別屬于第一和第三類，而且至少有4條譜帶缺失；采用IEF(pH3.5-10)分析發(fā)現(xiàn)，DawDam種子成熟過程中明顯缺少pI為4.56的LOX同工酶(II)；采用Westem blotting分析也發(fā)現(xiàn)，LOX-3缺少品種Daw Dam的LOX缺少譜帶分別屬于兩大類。由于LOX-3缺少品種Daw Dam的LOX-3缺少并不是一個同工酶，而是缺少等電點較小的一類LOX，因此建議把種子

5、發(fā)育過程中的LOX同工酶劃分為LOX-I類、LOX-II類和LOX-III類。 進一步的免疫電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，越光和Daw Dam的種子發(fā)育進程中，LOX蛋白并不出現(xiàn)在油體上，而是分布在蛋白貯藏囊泡(protein storage vacuole，PSV)的四周，因此與底物在空間上是分離的。但是在貯藏過程中，稻谷通常會自身發(fā)生細胞結(jié)構(gòu)損傷和化學成分的改變，前者包括脂質(zhì)體的溶合、細胞膜完整性下降、透性增加和細胞溶質(zhì)功能的喪失。因此，也

6、會導(dǎo)致LOX與底物的靠近，啟動LOX參與的脂質(zhì)過氧化，催化生成的脂氫過氧化物再被脂氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide lyases，HPLs)和脂氫過氧化物異構(gòu)酶(hydroperoxide isomerases，HPIs)降解或自動氧化為具有揮發(fā)性的己醛、戊醛和戊醇等羰基類低分子化合物，從而產(chǎn)生與稻米陳化變質(zhì)有關(guān)的陳米霉味。此外，也不排除LOX作為儲藏蛋白或合成傳遞生物脅迫和非生物脅迫信息信號分子的可能性。 進一步克

7、隆并報道一個新的水稻種子脂氧合酶的編碼基因OsLOX3，該基因位于水稻第三染色體，并與OsLOX1/2呈基因簇排列。與OsLOX1/2相比，OsLOX3表達產(chǎn)物的等電點是最小的，其在染色體上的位置與本實驗室耐貯性的QTL定位結(jié)果也是一致的。與OsLOX3相比，發(fā)現(xiàn)MiniOsLOX3在第四外元處存在有點突變，因此發(fā)生提前終止的現(xiàn)象，其原核表達產(chǎn)物的分子量為28 kDa，但是也具有一定的酶活性。最后，對位于水稻第三染色體的脂氧合酶基因簇進