線粒體抗氧化酶Trx2在D-半乳糖誘導(dǎo)的聽(tīng)皮層早衰中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 D-半乳糖誘導(dǎo)的聽(tīng)皮層擬老化大鼠模型的建立
　　目的:D-半乳糖誘導(dǎo)的Sprague-Dawley（SD）大鼠聽(tīng)皮層擬老化模型的建立。方法:2個(gè)月齡SD雄性大鼠162只，隨機(jī)分為對(duì)照組和擬老化組：其中擬老化組大鼠給予頸背部皮下注射500mg/kg/d的D-半乳糖，連續(xù)8周；對(duì)照組大鼠頸背部皮下注射等體積生理鹽水，連續(xù)8周。造模結(jié)束后，擬老化組和對(duì)照組各分為三個(gè)年齡亞組:4個(gè)月齡組（即造模完成后0個(gè)月）、10個(gè)月齡組（即造

2、模完成后6個(gè)月）和16個(gè)月組（即造模完成后12個(gè)月）。每個(gè)亞組27只SD大鼠。完成造模后，檢測(cè)每只大鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)（Auditory Brainstem Response，ABR）；酶標(biāo)儀比色法檢測(cè)總超氧化歧化酶（Total Superoxide Dismutase，T-SOD）的變化以及還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比值（Glutathione：Oxidant glutathione,GGSH:GSSG）的變化；高效液相色譜分析法和酶

3、標(biāo)儀比色法檢測(cè)丙二醛(Malondialdehyde，MDA)濃度的變化；實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)聽(tīng)皮層線粒體DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)常見(jiàn)缺失（Commen Deletion,CD）的變化；通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色來(lái)檢測(cè)聽(tīng)皮層組織細(xì)胞數(shù)量變化；通過(guò)透射電鏡（Transmission electron microscopy，TEM）來(lái)檢測(cè)大鼠聽(tīng)皮層組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；通過(guò)原位末端標(biāo)記法（Terminal Deoxy

4、nucleotidyl Transferase(TdT)-mediated Deoxyuridine Triphosphate(dUTP) Nick-End-Labelling TUNEL）來(lái)觀察神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：ABR結(jié)果示在4月齡，10月齡，16月齡時(shí)，相同頻率（4kHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz）擬老化組和對(duì)照組比較，閾值變化不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；比色法結(jié)果示：與對(duì)照組相比，10

5、月齡與16月齡擬老化組大鼠聽(tīng)皮層SOD活性降低（P<0.01）,GSH:GSSG比值降低（P<0.05）；比色法與高效液相色譜法顯示，擬老化組 MDA濃度明顯增加(P<0.05)；甲苯胺藍(lán)染色示，擬老化組大鼠聽(tīng)皮層組織神經(jīng)元與同月齡對(duì)照組相比數(shù)量降低，16月齡時(shí)，變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，同月齡的擬老化組與對(duì)照組大鼠相比神經(jīng)纖維脫髓鞘樣變、線粒體腫脹、脂褐素沉積、染色質(zhì)固縮、細(xì)胞核變形等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)退行性變更

6、為明顯且出現(xiàn)時(shí)間更早；TUNE染色結(jié)果顯示，擬老化組大鼠聽(tīng)皮層細(xì)胞凋亡數(shù)目與同月齡的對(duì)照組大鼠相比，10月齡和16月齡細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論:高劑量 D-半乳糖導(dǎo)致聽(tīng)皮層抗氧化酶活性降低、氧化應(yīng)激增加、mtDNA CD蓄積、神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)退行性變明顯、神經(jīng)元密度下降、凋亡數(shù)目增多，促進(jìn)了大鼠聽(tīng)皮層組織的衰老過(guò)程。
　　第二部分探討線粒體抗氧化酶Trx2在 D-半乳糖誘導(dǎo)的聽(tīng)皮層早

7、衰中的作用
　　目的:我國(guó)社會(huì)老齡化趨勢(shì)日益明顯，在困擾老年人健康的慢性疾病中，老年性聾已躋身于第三位，僅次于高血壓與關(guān)節(jié)炎。老年性聾是影響老年人生活質(zhì)量的主要疾病之一，有研究表明老年性聾與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，然而老年性聾的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。硫氧還蛋白2（Thioredoxin2,Trx2)是特異位于線粒體的小分子蛋白，它在抗氧化應(yīng)激、阻止線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著不可忽略的作用。本項(xiàng)研究意在探討Trx2在D-半乳糖誘導(dǎo)的

8、聽(tīng)皮層擬老化中的可能的作用機(jī)制。
　　方法：2個(gè)月齡SD雄性大鼠114隨機(jī)分為對(duì)照組和擬老化組：其中擬老化組大鼠給予頸背部皮下注射500mg/kg/d的D-半乳糖，連續(xù)8周；對(duì)照組大鼠頸背部皮下注射等體積生理鹽水，連續(xù)8周。造模結(jié)束后，擬老化組和對(duì)照組各分為三個(gè)年齡亞組:4個(gè)月齡組（即造模完成后0個(gè)月）、10個(gè)月齡組（即造模完成后6個(gè)月）和16個(gè)月組（即造模完成后12個(gè)月）。RT-PCR檢測(cè)硫氧還蛋白2(Thiredoxin2,T

9、rx2)，硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(Thioredoxin-Interacting Protein,TXNIP)和凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（Apoptosis Signal Regulating Kinase1，ASK1）mRNA表達(dá)；western blot檢測(cè) Trx2,TXNIP和ASK1蛋白表達(dá)；western blot檢測(cè)ASK1活性變化；免疫共沉淀檢測(cè)Trx2-TXNIP及Trx2-ASK1復(fù)合體的變化；免疫熒光技術(shù)檢測(cè) Trx2和AS

10、K1在聽(tīng)皮層組織的表達(dá)及定位；免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)TXNIP在聽(tīng)皮層組織的表達(dá)及定位。
　　結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，擬老化組大鼠Trx2 mRNA水平在4月齡，10月齡和16月齡分別下降了1.16-，1.40-(P<0.01)，和1.45-倍(P<0.01)，TXNIP mRNA水平分別上升了1.39-(P<0.05)，1.40-(P<0.01)，和1.50-倍(P<0.05)，ASK1mRNA水平分別上升了1.

11、18-,1.25-(P<0.01),和1.26-倍(P<0.01)；在對(duì)照組，16月齡大鼠與4月齡大鼠相比，Trx2 mRNA水平降低了1.29倍(P<0.05)，而TXNIP與ASK1 mRNA水平分別升高了1.59-(P<0.05)和1.12-倍。在擬老化組，16月齡大鼠與4月齡大鼠相比，Trx2 mRNA水平降低了1.29倍(P<0.05)，而TXNIP與ASK1 mRNA水平分別升高了1.71倍(P<0.01)和1.42倍。We

12、stern blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，擬老化組大鼠在4月齡，10月齡和16月齡中 Trx2水平分別降低1.50-，1.61-(P<0.05)和1.56-倍(P<0.05)，TXNIP水平分別上升了1.34-(P<0.05),1.44-(P<0.05),和1.57-倍(P<0.05)，ASK1水平分別上升了1.15-,2.19-(P<0.01)和2.17-倍(P<0.01)；我們的western blot結(jié)果還顯示，在對(duì)照組和擬老化

13、組，Trx2蛋白隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，而TXNIP和ASK1蛋白水平隨年齡的增長(zhǎng)而升高。在對(duì)照組中，16月齡與4月齡相比，Trx2蛋白下降1.54倍，TXNIP蛋白上升1.42倍（P<0.05），ASK1蛋白上升1.59倍。在擬老化組中，16月齡與4月齡相比，Trx2蛋白下降1.77倍(P<0.01)倍，TXNIP蛋白上升2.30-倍（P<0.01），ASK1蛋白上升1.75-倍（P<0.05）。此外，ASK1活性在擬老化組明顯增加，并

14、且隨著年齡的增長(zhǎng)而增加（P<0.01）。免疫沉淀結(jié)果顯示：Trx2-TXNIP和Trx2-ASK1復(fù)合體僅存在于線粒體，并且與對(duì)照組相比，4月齡，10月齡和16月齡擬老化組 Trx2-TXNIP復(fù)合體分別增加了1.63-(P<0.05),1.21-(P<0.05)和1.26-倍(P<0.01)，而Trx2-ASK1復(fù)合體分別降低了1.09-(P<0.05),1.48-(P<0.01)和1.37-倍(P<0.05)。與此同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，

15、Trx2-TXNIP復(fù)合體隨年齡的增加而增多，但Trx2-ASK1復(fù)合體隨年齡的增加而減少。在對(duì)照組，16月齡大鼠與4月齡大鼠相比，Trx2-TXNIP復(fù)合體增加了2.38倍（P<0.01）而Trx2-ASK1復(fù)合體降低了2.61倍(P<0.01)。在擬老化組，16月齡大鼠與4月齡大鼠相比，Trx2-TXNIP復(fù)合體增加了2.99倍(P<0.01)而 Trx2-ASK1復(fù)合體降低了2.01(P<0.01)倍。
　　結(jié)論：聽(tīng)皮層Tr