Sestrin2蛋白一級(jí)自噬在D-半乳糖誘導(dǎo)的擬老化大鼠聽皮層中的作用及作用機(jī)制.pdf

1、第一部分D-半乳糖誘導(dǎo)的SD大鼠擬老化模型的建立
　　目的:建立 D-半乳糖誘導(dǎo)的擬老化SD大鼠模型。
　　方法:90只4周齡的SD大鼠，隨機(jī)分為兩組, D-半乳糖組(擬老化組）：于頸背部皮下，注射500mg/kg/d D-半乳糖，連續(xù)8周；對(duì)照組：等體積0.9％的生理鹽水，頸背部皮下注射，連續(xù)8周。造模結(jié)束后，D-半乳糖組和對(duì)照組按時(shí)間點(diǎn)各分為三個(gè)亞組：3月齡組（給藥結(jié)束后0個(gè)月），9月齡組（給藥結(jié)束后6個(gè)月）和15月齡組

2、（給藥結(jié)束后12個(gè)月）。給藥結(jié)束后，檢測(cè)大鼠聽性腦干反應(yīng)（Auditory Brainstem Response, ABR）；酶標(biāo)儀檢測(cè)總超氧化歧化酶（Total Superoxide Dismutase, T-SOD）和丙二醛（Malondialdehyde termimal，MDA）的水平；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)聽皮層線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)常見缺失突變（Common Deletion, CD）的

3、水平；甲苯胺藍(lán)染色法觀察聽皮層神經(jīng)元細(xì)胞密度的變化；透射電鏡觀察聽皮層神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果：ABR聽力檢測(cè)顯示：在相同頻率（4KHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz），同齡D-半乳糖組和對(duì)照組相比，聽力閾值未見顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。對(duì)照組中，在8kHz、16kHz、24kHz、32kHz頻率,15月齡較9月齡，3月齡大鼠聽力閾值增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。D-半乳糖組中，在4

4、KHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz頻率，15月齡較9月齡、3月齡大鼠聽力閾值增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與同齡對(duì)照組相比，9月齡、15月齡D-半乳糖組大鼠T-SOD水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與同齡對(duì)照組相比，3月齡，9月齡，15月齡D-半乳糖組大鼠MDA水平增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。D-半乳糖組mt DNA CD與同齡對(duì)照組相比升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

5、在對(duì)照組中，15月齡大鼠聽皮層mtDNA CD比3月齡以及9月齡大鼠聽皮層mt DNA CD缺失率升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甲苯胺藍(lán)染色法顯示，15月齡D-半乳糖組較其他各年齡組神經(jīng)元密度下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。透射電鏡觀察到D-半乳糖組大鼠比對(duì)照組大鼠出現(xiàn)衰老樣超微結(jié)構(gòu)病理變化如細(xì)胞核變形、染色質(zhì)異常分布、線粒體腫脹、脂褐素聚集、神經(jīng)纖維脫髓鞘樣變等的時(shí)間更早，而且這些變化更顯著。
　　結(jié)論：

6、隨年齡增長(zhǎng)，聽皮層抗氧化酶的活性下降，mtDNA CD蓄積增加，神經(jīng)元密度降低，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸出現(xiàn)退行性變，而且D-半乳糖組較對(duì)照組這些變化出現(xiàn)的更早，更明顯。長(zhǎng)時(shí)程、高劑量的D-半乳糖會(huì)加速聽皮層細(xì)胞的衰老。
　　第二部分 Sestrin2蛋白以及自噬在D-半乳糖誘導(dǎo)的擬老化大鼠聽皮層中的作用及作用機(jī)制
　　目的:老年性聾是老年人最常見的感覺障礙疾病，它會(huì)導(dǎo)致老年人身體、認(rèn)知、情緒、行為等一系列的功能障礙。目前老年性聾

7、的發(fā)病機(jī)制還不清楚。本研究目的是探討自噬，以及自噬相關(guān)調(diào)控通路蛋白Sestrin2，AMPK以及p70S6K蛋白在D-半乳糖擬老化大鼠聽皮層中的作用。
　　方法：將120只4周齡的SD大鼠，隨機(jī)分為兩組給藥：D-半乳糖組（擬老化組）：D-半乳糖500mg/kg/d，頸背部皮下注射，連續(xù)8周；對(duì)照組：等體積0.9%生理鹽水，頸背部皮下注射，連續(xù)8周。給藥結(jié)束后，D-半乳糖組和對(duì)照組按時(shí)間點(diǎn)各分為三個(gè)亞組：3月齡組（給藥結(jié)束后0個(gè)月）

8、,9月齡組（給藥結(jié)束后6個(gè)月）和15月齡組（給藥結(jié)束后12個(gè)月）。酶標(biāo)儀檢測(cè)總超氧化歧化酶（Total Superoxide Dismutase, T-SOD）和丙二醛（Malondialdehyde termimal，MDA）的水平；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)聽皮層線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)常見缺失突變（Common Deletion, CD）的水平。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)beclin1/Atg6, LC3

9、B/Atg8, Sestrin2 mRNA的表達(dá)水平。Westrrn blotting法檢測(cè)LC3B, Beclin1, Sestrin2, p-p70S6K, p70S6K, p-AMPK, AMPK的蛋白水平。免疫熒光檢測(cè)LC3B在聽皮層的定位表達(dá)。
　　結(jié)果：9月齡以及15月齡D-半乳糖組大鼠T-SOD水平較同齡對(duì)照組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3月齡，9月齡以及15月齡D-半乳糖組大鼠MDA水平比同齡對(duì)照組增

10、高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 D-半乳糖大鼠聽皮層mt DNA CD與同齡對(duì)照組相比升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)照組組內(nèi)比較，15月齡大鼠聽皮層mtDNA CD比3月齡以及9月齡大鼠聽皮層mt DNA CD升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示，與同齡對(duì)照組相比，9月齡D-半乳糖組大鼠聽皮層Atg6mRNA表達(dá)水平上升1.09倍, P<0.05；與同齡對(duì)照組相比，3月齡以及9月齡D-半

11、乳糖組大鼠聽皮層Atg8mRNA表達(dá)水平分別上升0.2和0.27倍, P<0.05；Sestrin2 mRNA表達(dá)水平分別上升0.33和0.52倍, P<0.05。15月齡時(shí)，與對(duì)照組相比，D-半乳糖組Atg6mRNA、Atg8mRNA、Sestrin2 mRNA表達(dá)水平分別下降0.76倍，0.33倍和0.83倍, P<0.05。對(duì)照組組內(nèi)比較時(shí)，9月齡以及15月齡大鼠較3月齡大鼠聽皮層Atg8mRNA表達(dá)水平分別上升0.29和0.21

12、倍, P<0.05；Sestrin2 mRNA表達(dá)水平分別上升0.62和0.83倍, P<0.05。Western blotting結(jié)果顯示：與同齡對(duì)照組相比，3月齡以及9月齡D-半乳糖組聽皮層Beclin1蛋白水平分別升高0.34，0.52倍, P<0.05；LC3Ⅱ/β-actin比率分別升高0.71和1.21倍, P<0.05；Sestrin2蛋白水平分別升高1.03和0.27倍, P<0.05；p-AMPK/AMPK比率升高1.

13、57和0.67倍, P<0.05, p-p70S6K/p70S6K比率下降1.86和1.21倍, P<0.05。15月齡時(shí)，與對(duì)照組相比，D-半乳糖組大鼠Beclin1蛋白水平下降0.31倍，LC3Ⅱ/β-actin下降0.80倍，Sestrin2蛋白水平下降0.37倍，p-AMPK/AMPK比率下降1.11倍, p-p70S6K/p70S6K比率升高1.89倍, P<0.05。在對(duì)照組中，9月齡、15月齡較3月齡大鼠LC3Ⅱ/β-ac

14、tin比率升高0.61和0.37倍, P<0.05;Sestrin2蛋白水平升高0.58和0.58倍, P<0.05;p-AMPK/AMPK比率升高0.71和1.04倍, P<0.05；p-p70S6K/p70S6K比率下降1.63和1.62倍, P<0.05。
　　結(jié)論：在D-半乳糖誘導(dǎo)的擬老化SD大鼠年齡增長(zhǎng)的過程中，自噬水平也在改變，Setrin2-AMPK-p70S6K可能參與年齡相關(guān)的自噬活動(dòng)的調(diào)節(jié)。大鼠年輕時(shí)，即3月齡