海蜇口腕部糖蛋白理化性質(zhì)及生物活性研究.pdf

1、海蜇(Rhopilema esculehtum Kishinouye)是一種大型的食用水母，在我國有著廣泛的資源分布，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值、營養(yǎng)價值和藥用價值。近代研究表明海蜇有治療高血壓、慢性氣管炎、哮喘、胃潰瘍和單純性甲狀腺腫大等作用。從海蜇的營養(yǎng)保健及藥學(xué)功能來看，海蜇具有進(jìn)一步開發(fā)和利用的價值。目前，海蜇的一些化學(xué)成分及生物活性已經(jīng)被研究探討，如蛋白，毒素，多肽和糖胺聚糖等，但關(guān)于海蜇口腕部糖蛋白的研究未見報道。 本論文以

2、青島附近黃海海域的新鮮海蜇為原料，采用現(xiàn)代的分離純化技術(shù)，儀器分析技術(shù)，藥理研究技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)，從海蜇口腕部分離純化出一種新的糖蛋白(JGP-Ⅲ)，并對其理化性質(zhì)，清除自由基活性，免疫活性進(jìn)行研究，旨在為海蜇資源的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。實(shí)驗(yàn)主要獲得如下研究結(jié)果： 1.利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析方法中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計，對海蜇口腕部糖蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，糖蛋白提取的最佳工藝條件為：提取

3、溶劑為pH值為7.26的PBS，料液比為l：4，提取時7h。在此基礎(chǔ)上。進(jìn)行超聲輔助提取，提取的最佳工藝條件是：超聲處理時間為15min，超聲功率為300W，提取時間60min。在此優(yōu)化條件下，目標(biāo)糖蛋白的得率為9.14％。 2.海蜇口腕部提取液經(jīng)乙醇分級沉淀，Sp Sephadex C-25陽離子交換柱層析初步分離，得到3組份，分別為JGP-Ⅱ，JGP-Ⅲ，JGP-Ⅳ，選擇糖和蛋白含量及活性較高的組分JGP-Ⅲ進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4、JGP-Ⅲ經(jīng)Sephacryl S300HR層析柱，Sepharose CL-6B柱層析和HPLC鑒定JGP-Ⅲ呈現(xiàn)單一對稱的峰；經(jīng)SDS-PAGE電泳后，通過PAS和考馬斯亮蘭兩種染色方法，在凝膠上相應(yīng)的位置出現(xiàn)了一條帶。以上結(jié)果顯示JGP-Ⅲ是組成均一的糖蛋白，而不是糖和蛋白的混合物。得率約為0.5％(占海蜇口腕部干基重)。 3.JGP-Ⅲ凍干粉是白色絮狀粉末，易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑。經(jīng)化學(xué)分析方法測定，

5、JGP-Ⅲ,含有12.61％總糖，74.34％總蛋白，8.47％氨基糖，0.84％糖醛酸，1.06％硫酸根、0.92％唾液酸。JGP-Ⅲ經(jīng)SDS-PAGE測定分子量為109.7kDa，經(jīng)HPLC測定，其分子量為85.3 kDa，兩種方法測定得到的分子量有一定差別。JGP-Ⅲ的Td值為31.6℃，Ts值為61.74℃。 JGP-Ⅲ的單糖組成主要有氨基葡萄糖，氨基半乳糖，葡萄糖，甘露糖，巖藻糖和鼠李糖。氨基酸組成中甘氨酸含量最高，其次為纈氨

6、酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天門冬氨酸等，缺乏色氨酸和組氨酸。JGP-Ⅲ經(jīng)消除反應(yīng)前后紫外吸收和氨基酸組成的變化，說明JGP-Ⅲ中有0-連接糖苷鍵的存在。經(jīng)糖肽酶F作用后，分子量發(fā)生明顯變化，說明JGP-Ⅲ中有N-連接糖苷鍵的存在。JGP-Ⅲ的紅外圖譜具有典型的糖蛋白特征，再次證明JGP-Ⅲ是一種糖和蛋白的復(fù)合物。NMR圖譜顯示了JGP-Ⅲ結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。以上結(jié)果顯示JGP-Ⅲ是一種新的糖蛋白，這為JGP-Ⅲ的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

7、 4.試驗(yàn)通過化學(xué)發(fā)光的方法，檢測JGP-Ⅲ具有較強(qiáng)的清除羥自由基和超氧自由基能力。JGP-Ⅲ的由糖部分和蛋白部分共同參與清除自由基活動；在清除自由基活動中，N-連接的寡糖鏈起到主要的作用；當(dāng)溫度達(dá)到熱收縮溫度61.74℃(即蛋白纖維收縮到原來的1/3)時，清除自由基能力最強(qiáng)，說明JGP-Ⅲ清除自由基活性與其空間三維結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系。 5.采用JGP-Ⅲ溶液灌胃免疫低下模型小鼠，探討了JGP-Ⅲ免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)果表明，不同劑量組的

8、JGP-Ⅲ均能提高小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)(P<0.05)；顯著提高荷瘤小鼠血清溶血素含量(P<0.01)和抗體形成細(xì)胞數(shù)(P<0.05)；提高遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬能力(P<0.05，P<0.01)。提示JGP-Ⅲ能全面調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性和非特異性免疫功能，從而提高機(jī)體免疫能力。 6.用MTT法檢測了JGP-Ⅲ對從小鼠的脾臟細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞的增殖活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JGP-Ⅲ可以促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖活性，并且