Tiam1基因沉默對結腸癌淋巴管生成的影響.pdf

1、背景與目的： 侵襲轉移是惡性腫瘤的基本特征，也是腫瘤患者死亡的主要原因之一。淋巴道是大部分腫瘤最常見的轉移途徑，有無淋巴結轉移也是判斷患者預后的重要指標。近年來隨著淋巴管標記物的發(fā)現(xiàn)，在某些惡性腫瘤中已經(jīng)證實有淋巴管生成，被稱為淋巴管生成因子的VEGF-C、VEGF-D通過其受體VEGFR-3能夠誘導淋巴管的生成。惡性腫瘤中的淋巴管生成因子不但能夠促進腫瘤淋巴管的生成，而且增加淋巴道轉移的幾率。結腸癌(colon cancer)

2、是臨床最常見的惡性腫瘤之一，淋巴結轉移是其發(fā)生侵襲轉移的重要途徑，同時也是影響患者預后的重要因素。因此了解結腸癌淋巴管生成的情況及其存在的內(nèi)在機制對于結腸癌的臨床治療有相當重要的意義。 T細胞淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1(Tiaml)是從小鼠T淋巴瘤細胞中分離出來的一個基因，是Ras相關的C3肉毒素底物1(Racl)的特異性鳥苷酸轉換因子(GEF)，在細胞外信號刺激下可以激活Racl，影響細胞的骨架重建、粘附運動、增殖分化和凋亡等。

3、Tiaml與腫瘤的侵襲轉移密切相關。但促進腫瘤侵襲轉移的基因Tiaml是否與腫瘤淋巴管生成有關尚不清楚。因此，我們擬通過Tiaml基因沉默對結腸癌組織中淋巴管生成因子VEGF-C/D表達影響的研究，了解其是否對結腸癌的淋巴管生成、淋巴結轉移產(chǎn)生影響，從而初步探討結腸癌發(fā)生淋巴道轉移的機制。 研究方法： 首先，通過免疫組化的方法，檢測結腸癌組織中Tiaml、Racl和VEGF-C/D的表達情況，同時利用統(tǒng)計學方法，分析Ti

4、aml表達同Racl、VEGF-C/D、微淋巴管密度、淋巴結轉移情況以及其他一些臨床病理特征的相關性。 其次，構建Tiaml RNA干擾載體，體外培養(yǎng)結腸癌細胞，用RT-PCR和Western blot篩選高表達Tiaml的細胞并檢測Tiaml基因沉默對結腸癌細胞Racl、VEGF-C/D表達的影響。 最后，將Tiaml RNA干擾載體轉染結腸癌細胞HCT116，篩選轉染穩(wěn)定表達的細胞。采用背部皮下種植的的方法造成裸鼠荷

5、瘤模型。比較干擾組與對照組種植瘤在淋巴管生成、淋巴結轉移方面差異。 結果： 在結腸癌組織切片免疫組化檢測中，可觀察到Tiaml和Racl蛋白在癌細胞中呈高表達，而周圍正常組織表達陰性。在50例標本中，Tiaml和Racl的陽性率均為84％，二者表達具有一致性；有淋巴結轉移的患者與無轉移的患者之間，Tiaml/Racl的陽性率差異顯著(P<0.05)。VEGF-C/D也表達于癌細胞的細胞質(zhì)，在腫瘤周圍正常組織中則基本沒有表

6、達，二者中以VEGF-C表達多見。淋巴結轉移患者的VEGF-C/D陽性率高于無淋巴結轉移的患者的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義。結腸癌組織中Tiaml也與VEGF-C和淋巴管密度有關。結腸癌組織中Tiaml、Racl和VEGF-C/D的表達在患者的年齡、性別、分化程度等方面差異不顯著(P>0.05)。 在體外實驗中，成功構建了Tiaml RNA干擾載體，轉染并篩選穩(wěn)定表達的結腸癌細胞，經(jīng)RT-PCR和Western blot方法證實T

7、iaml RNAi質(zhì)?？擅黠@抑制Tiaml的表達。當Tiaml基因沉默后，VEGF-C/D表達減弱，而且Racl表達也減弱。由此推測Tiaml可以促進VEGF-C/D表達，而且可能通過Tiaml/Racl信號途徑起作用。 在動物體內(nèi)實驗中，將Tiaml RNA干擾載體轉染HCT116細胞。干擾組裸鼠種植瘤與對照組種植瘤相比較，生長相同天數(shù)后，干擾組的淋巴管密度比對照組明顯減少，并有統(tǒng)計學意義。 結論： 本課題從臨

8、床觀察、體外實驗及動物體內(nèi)實驗三個層面探討了Tiam 1/Racl信號通路在結腸癌淋巴管生成中的作用，認為(1)人結腸癌組織中不同程度表達Tiaml、Racl及VEGF-C/D蛋白；Tiaml與Racl表達密切相關，并且Tiaml和VEGF-C表達、淋巴管密度、淋巴結轉移顯著相關。 (2)成功構建Tiaml RNAi質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和測序證實干擾質(zhì)粒序列完全正確。(3)成功將Tiaml RNAi質(zhì)粒轉染結腸癌細胞，經(jīng)綠色熒光、G418抗