Tiam1基因沉默對結(jié)腸癌淋巴管生成的影響.pdf

1、背景與目的： 侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征，也是腫瘤患者死亡的主要原因之一。淋巴道是大部分腫瘤最常見的轉(zhuǎn)移途徑，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也是判斷患者預(yù)后的重要指標(biāo)。近年來隨著淋巴管標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，在某些惡性腫瘤中已經(jīng)證實(shí)有淋巴管生成，被稱為淋巴管生成因子的VEGF-C、VEGF-D通過其受體VEGFR-3能夠誘導(dǎo)淋巴管的生成。惡性腫瘤中的淋巴管生成因子不但能夠促進(jìn)腫瘤淋巴管的生成，而且增加淋巴道轉(zhuǎn)移的幾率。結(jié)腸癌(colon cancer)

2、是臨床最常見的惡性腫瘤之一，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要途徑，同時也是影響患者預(yù)后的重要因素。因此了解結(jié)腸癌淋巴管生成的情況及其存在的內(nèi)在機(jī)制對于結(jié)腸癌的臨床治療有相當(dāng)重要的意義。 T細(xì)胞淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(Tiaml)是從小鼠T淋巴瘤細(xì)胞中分離出來的一個基因，是Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Racl)的特異性鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子(GEF)，在細(xì)胞外信號刺激下可以激活Racl，影響細(xì)胞的骨架重建、粘附運(yùn)動、增殖分化和凋亡等。

3、Tiaml與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基因Tiaml是否與腫瘤淋巴管生成有關(guān)尚不清楚。因此，我們擬通過Tiaml基因沉默對結(jié)腸癌組織中淋巴管生成因子VEGF-C/D表達(dá)影響的研究，了解其是否對結(jié)腸癌的淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，從而初步探討結(jié)腸癌發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制。 研究方法： 首先，通過免疫組化的方法，檢測結(jié)腸癌組織中Tiaml、Racl和VEGF-C/D的表達(dá)情況，同時利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析Ti

4、aml表達(dá)同Racl、VEGF-C/D、微淋巴管密度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及其他一些臨床病理特征的相關(guān)性。 其次，構(gòu)建Tiaml RNA干擾載體，體外培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞，用RT-PCR和Western blot篩選高表達(dá)Tiaml的細(xì)胞并檢測Tiaml基因沉默對結(jié)腸癌細(xì)胞Racl、VEGF-C/D表達(dá)的影響。 最后，將Tiaml RNA干擾載體轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，篩選轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞。采用背部皮下種植的的方法造成裸鼠荷

5、瘤模型。比較干擾組與對照組種植瘤在淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異。 結(jié)果： 在結(jié)腸癌組織切片免疫組化檢測中，可觀察到Tiaml和Racl蛋白在癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，而周圍正常組織表達(dá)陰性。在50例標(biāo)本中，Tiaml和Racl的陽性率均為84％，二者表達(dá)具有一致性；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者與無轉(zhuǎn)移的患者之間，Tiaml/Racl的陽性率差異顯著(P<0.05)。VEGF-C/D也表達(dá)于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，在腫瘤周圍正常組織中則基本沒有表

6、達(dá)，二者中以VEGF-C表達(dá)多見。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的VEGF-C/D陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)腸癌組織中Tiaml也與VEGF-C和淋巴管密度有關(guān)。結(jié)腸癌組織中Tiaml、Racl和VEGF-C/D的表達(dá)在患者的年齡、性別、分化程度等方面差異不顯著(P>0.05)。 在體外實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了Tiaml RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR和Western blot方法證實(shí)T

7、iaml RNAi質(zhì)?？擅黠@抑制Tiaml的表達(dá)。當(dāng)Tiaml基因沉默后，VEGF-C/D表達(dá)減弱，而且Racl表達(dá)也減弱。由此推測Tiaml可以促進(jìn)VEGF-C/D表達(dá)，而且可能通過Tiaml/Racl信號途徑起作用。 在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將Tiaml RNA干擾載體轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞。干擾組裸鼠種植瘤與對照組種植瘤相比較，生長相同天數(shù)后，干擾組的淋巴管密度比對照組明顯減少，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 本課題從臨

8、床觀察、體外實(shí)驗(yàn)及動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)三個層面探討了Tiam 1/Racl信號通路在結(jié)腸癌淋巴管生成中的作用，認(rèn)為(1)人結(jié)腸癌組織中不同程度表達(dá)Tiaml、Racl及VEGF-C/D蛋白；Tiaml與Racl表達(dá)密切相關(guān)，并且Tiaml和VEGF-C表達(dá)、淋巴管密度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。 (2)成功構(gòu)建Tiaml RNAi質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定和測序證實(shí)干擾質(zhì)粒序列完全正確。(3)成功將Tiaml RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞，經(jīng)綠色熒光、G418抗