NRP2介導(dǎo)Sema3F信號(hào)對(duì)結(jié)腸癌淋巴管生成及轉(zhuǎn)移的影響研究.pdf

1、背景與目的: 結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，淋巴道轉(zhuǎn)移是其最常見的轉(zhuǎn)移方式。目前腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成的分子機(jī)制尚不清楚。 Neuropilins(NRPs)為跨膜糖蛋白，首先證實(shí)為神經(jīng)導(dǎo)向因子semaphorins3(sema)的主要受體，近來發(fā)現(xiàn)它也是某些特殊亞型的血管內(nèi)皮生長因子(如VEGF165、VEGF145和VEGF-c等)的一種復(fù)合受體。目前研究發(fā)現(xiàn)NRPs具有兩種功能：在神經(jīng)導(dǎo)向中，NRP2只

2、與Sema3F結(jié)合引起頸上神經(jīng)節(jié)阻斥。在脈管生成中，NRPs為近年發(fā)現(xiàn)的VEGF新型受體，常與VEGF165結(jié)合誘導(dǎo)血管生成。這樣兩個(gè)不同的配體(Sema和VEGF)結(jié)合同一受體(NRPs)，并介導(dǎo)兩個(gè)不同的過程--神經(jīng)導(dǎo)向和血管生成，提示這些過程可能具有共同的分子機(jī)制。 NRPs在胚胎脈管發(fā)育中也具有重要作用，其中NRP2與淋巴管發(fā)生密切相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)在純合子NRP2突變動(dòng)物，出現(xiàn)小淋巴管和毛細(xì)淋巴管缺乏或數(shù)量減少，而血管系統(tǒng)和

3、其他的大集合淋巴管發(fā)育正常。提示NRP2對(duì)胚胎淋巴管發(fā)育具有一種選擇性的需要。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)胚胎早期從靜脈出芽形成的原始淋巴管并不需要NRP2參與，而在其后期從原有淋巴管內(nèi)皮出芽形成新生淋巴管的過程中NRP2卻十分必要。表明NRP2對(duì)成熟組織的毛細(xì)淋巴管形成具有非常重要的作用。然而在神經(jīng)軸突導(dǎo)向中，Sema3F與NRP2結(jié)合所激發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)卻引起神經(jīng)元軸突生長錐萎縮。Sema3F對(duì)表達(dá)NRP2的結(jié)腸淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞來說，是否也同樣存在類似

4、軸突阻斥方式，從而抑制腫瘤淋巴管生成。為此推測Sema3F通過NRP2介導(dǎo)的信號(hào)不僅抑制神經(jīng)元軸突生長，也可能抑制腫瘤的淋巴管生成和腫瘤細(xì)胞淋巴管轉(zhuǎn)移。 在本研究中，我們檢測NRP2介導(dǎo)的Sema3F信號(hào)對(duì)結(jié)腸癌淋巴管生成及轉(zhuǎn)移的影響，初步探討其在結(jié)腸癌淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的潛在作用和機(jī)制，從而對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行初步探討。 研究方法: 首先，通過免疫組化的方法，檢測結(jié)腸癌組織中NRP2、Sema

5、3F和VEGF-C的表達(dá)情況，同時(shí)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析NRP2和Sema3F表達(dá)同VEGF-C表達(dá)、淋巴管密度(Microlymphaticdensity，MLD)、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(lymphaticendothelialcells，LECs)增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及其他一些臨床病理特征的相關(guān)性。 其次，構(gòu)建NRP2和VEGF-C的RNAi真核載體，并對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞進(jìn)行Sema3F轉(zhuǎn)染、NRP2RNAi和VEGF-CRNA

6、i；同時(shí)采取雙轉(zhuǎn)染的方法對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行Sema3F轉(zhuǎn)染+NRP2/VEGF-CRNAi，篩選相應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)克隆。建立裸鼠結(jié)腸原位種植的荷瘤模型。比較轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組種植瘤在淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖與凋亡方面的差異。 最后，采用免疫磁珠法分離毛細(xì)人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(humanlymphaticendothelialcells，hLECs)，并分別轉(zhuǎn)染NRP2的表達(dá)和RNAi干擾載體，篩選相應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)克隆。然后采用三維小管培養(yǎng)和

7、體外遷移實(shí)驗(yàn)，以及轉(zhuǎn)染Sema3F的結(jié)腸癌細(xì)胞與hLECs共培養(yǎng)等方法，觀察NRP2不同表達(dá)水平的hLECs體外小管形成能力和遷移能力的差異，以及與腫瘤細(xì)胞間的相互作用能力的差異。采用westernblot和RT-PCR檢測NRP2不同表達(dá)狀態(tài)的hLECs的integrinαvβ3表達(dá)水平，初步探討其機(jī)制。 結(jié)果: 1.podoplanin陽性定位于結(jié)腸癌及正常結(jié)腸組織LECs的胞膜和胞質(zhì)。結(jié)腸癌MLD均值為29.5±1

8、2.2，與正常結(jié)腸組織(25.4±8.0)無顯著性差異(P＞0.05)；腫瘤邊緣組織、腫瘤淺表部和腫瘤中心區(qū)MLD均值分別為48.8±23.5、24.6±10.1和11.3±7.7，三者間有顯著差異(P＜0.05)；腫瘤邊緣淋巴管多為擴(kuò)張狀，而腫瘤中心及淺表部位則多為閉鎖的條索狀。結(jié)腸癌組織中LECs的Ki-67labelindex(LⅠ)為0.17±0.12，而正常結(jié)腸組織hLECs幾乎沒有Ki-67表達(dá)。LECs的Ki-67LⅠ以腫

9、瘤邊緣區(qū)最高(0.22±0.12),腫瘤中央?yún)^(qū)最低(0.12±0.08)，腫瘤淺表區(qū)為0.15±0.10，其中腫瘤邊緣區(qū)Ki-67LI與腫瘤淺表區(qū)和中心區(qū)差異有顯著性(P＜0.05)。 2.腫瘤組織NRP2的mRNA表達(dá)為0.87±0.26高于其癌旁正常組織的0.38±0.12(p＜0.01)；轉(zhuǎn)移組癌組織NRP2的mRNA水平為1.12±0.25高于非轉(zhuǎn)移組的0.76±0.19(p＜0.01))。免疫組化檢測NRP2主要見于癌

10、細(xì)胞和LECs胞質(zhì)，陽性率34.8％，MLD與NRP2表達(dá)強(qiáng)度正相關(guān)(r=0.432，P＜0.01)。NRP2的表達(dá)和MLD與結(jié)腸癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke’s分期和侵潤程度相關(guān)(P＜0.05)，與患者年齡、腫瘤分化程度、性別、腫瘤大小和部位不相關(guān)(P＞0.05)。 3.腫瘤組織Sema3F的mRNA表達(dá)為1.26±0.17高于其癌旁正常組織的1.17±0.15(p＞0.05)；轉(zhuǎn)移組癌組織Sema3F的mRNA表達(dá)水平為1.2

11、0±0.16低于非轉(zhuǎn)移組的1.38±0.22(p＜0.05)；免疫組化檢測Sema3F主要見于癌組織，其中13例可見部分腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞核陽性著色，64例標(biāo)本中陽性率50％。Sema3F+組腫瘤組織MLD為21.8±10.2顯著低于Sema3F組的33.5±12.6(p＜0.05)。Sema3F的表達(dá)和MLD與結(jié)腸癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、Duke’s分期和侵潤程度相關(guān)(P＜0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小和部位不相關(guān)(P＞0

12、.05)。 4.結(jié)腸癌組織Smea3F表達(dá)與NRP2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.099，P=0.013)，VEGF-C表達(dá)與NRP2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.174，P=0.001)，但Smea3F表達(dá)與VEGF-C表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.606，P=0.001)。 5.成功構(gòu)建NRP2和VEGF-C的RNAi真核載體，順利轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，NRP2和VEGF-C基因的mRNA抑制率分別為76.5％和38.

13、6％、77.3％和75％。NRP2和VEGF-C基因的蛋白抑制率分別為74.9％和33.4％、76.6％和74.5％ 6.順利對(duì)LOVO細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sema3F基因、NRP2RNAi和VEGF-CRNAi載體；同時(shí)對(duì)LOVO細(xì)胞共轉(zhuǎn)染Sema3F+NRP2/VEGF-CRNAi載體。LOVO細(xì)胞裸鼠移植瘤與對(duì)照組移植瘤相比較，生長相同天數(shù)后，未轉(zhuǎn)染組MLD高于轉(zhuǎn)染組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。對(duì)照組全部出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，單純干擾VEG

14、F-C、NRP2組裸鼠未見腸系膜淋巴結(jié)的腫大，但腫瘤細(xì)胞種植超過8周以上，也發(fā)現(xiàn)各有6/12和7/12的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并逐漸出現(xiàn)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。單純轉(zhuǎn)染Sema3F組僅于腫瘤細(xì)胞種植后12周有膈肌轉(zhuǎn)移灶，并有2個(gè)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。共轉(zhuǎn)染Sema3F+NRP2RNAi的種植瘤于第8周也逐漸出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。但共轉(zhuǎn)染sema3F+VEGF-CRNAi的移植瘤未見腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移灶。表達(dá)sema3f的裸鼠移植瘤出現(xiàn)腺管樣結(jié)構(gòu)，壞死灶

15、間隙由大量的凋亡細(xì)胞和無增殖活性細(xì)胞組成。 7.成功分離純化毛細(xì)hLECs，免疫熒光檢測顯示hLECs表達(dá)D2-40、VEGFR3、NRP2、podoplnain和LYVE-1，但不表達(dá)Ⅷ因子；VEGF-C(10ng/ml)誘導(dǎo)組hLECs較對(duì)照組S期、G2/M期的細(xì)胞顯著增多(p＜0.05)。 8.順利對(duì)hLECs轉(zhuǎn)染NRP2表達(dá)載體和NRP2RNAi的載體。在體外實(shí)驗(yàn)中，NRP2過表達(dá)的hLECs小管成型、細(xì)胞遷移和

16、細(xì)胞粘附能力較下調(diào)NRP2和未干預(yù)的hLECs增強(qiáng)，且其integrinαvβ3表達(dá)水平也上調(diào)，但對(duì)hLECs的增殖能力沒有影響。表達(dá)Sema3F的LOVO細(xì)胞對(duì)NRP2過表達(dá)和未干預(yù)的hLECs出現(xiàn)化學(xué)排斥，而與下調(diào)NRP2的hLECs能融合生長。 結(jié)論: 1.NRP2、Sema3F和VEGF-C在結(jié)腸癌組織中表達(dá)，并且和腫瘤淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，Sema3F表達(dá)與NRP2和VEGF-C表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，NRP

17、2表達(dá)與VEGF-C表達(dá)呈正相關(guān)。 2.成功構(gòu)建NRP2和VEGF-C的RNAi真核載體對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞的NRP2和VEGF-C基因的mRNA和蛋白有明顯抑制作用。 3.Sema3F可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞呈良性分化，并通過與NRP2結(jié)合抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的淋巴管生成與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Sema3F與VEGF競爭性結(jié)合NRP2而抑制其促淋巴管生成。 4.成功分離純化和鑒定hLECs，并建立hLECs三維培養(yǎng)、hLECs和腫瘤細(xì)