麻疹病毒載體的優(yōu)化與改造.pdf

1、本文在如何提高拯救效率，提高下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，方便外源基因引入等方面進(jìn)行了探索，并對(duì)重組有外源基因的麻疹病毒全基因組感染性克隆進(jìn)行拯救。構(gòu)建了適合麻疹病毒感染的Vero細(xì)胞T7 RNA聚合酶穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，用以啟動(dòng)麻疹病毒全基因組的轉(zhuǎn)錄并與常用的痘苗病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行比較分析。 置于T7啟動(dòng)子控制下的全基因組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄水平受到很多因素影響，鳥(niǎo)嘌呤是其中的一個(gè)重要影響因素。構(gòu)建了麻疹病毒微復(fù)制子并以其為模型來(lái)研究如何提高病毒的拯救

2、效率。首先對(duì)鳥(niǎo)嘌呤和錘頭狀核酶對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響進(jìn)行比較分析，在麻疹病毒微復(fù)制子質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了含有3個(gè)鳥(niǎo)嘌呤(G)和錘頭狀核酶(HamRz)的PminiEGFP3G、2個(gè)G和HamRz的PminiEGFP2G、不含G只含HamRz的PminiEGFPOG和含有3個(gè)G但不含HamRz的PminiEGFP3G一共4個(gè)質(zhì)粒。拯救后通過(guò)熒光分析和FACS分析對(duì)4個(gè)質(zhì)粒的拯救效率進(jìn)行比較，結(jié)果表明，PminiEGFP3G的拯救效率最高，而Pm

3、iniEGFPOG的拯救效率比較低，PminiEGFP3G-質(zhì)粒由于與副粘病毒科6的倍數(shù)原則相違背，拯救效率最差。可見(jiàn)，鳥(niǎo)嘌呤對(duì)微復(fù)制子質(zhì)粒的拯救效率有影響，3個(gè)鳥(niǎo)嘌呤與錘頭狀核酶的結(jié)合是提高微復(fù)制子質(zhì)粒拯救效率的最佳組合。針對(duì)鳥(niǎo)嘌呤對(duì)麻疹病毒拯救效率的影響進(jìn)行了研究，為以T7啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的單股負(fù)鏈RNA病毒的拯救進(jìn)行了有益的探索。 MV病毒全基因組的轉(zhuǎn)錄是在T7啟動(dòng)子的控制下，產(chǎn)生的負(fù)鏈基因組與病毒結(jié)構(gòu)蛋白N、P、L形成RNP后，充當(dāng)

4、RNA合成的模板。但是在真核細(xì)胞中不具有T7RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄過(guò)程的實(shí)現(xiàn)必須通過(guò)外源來(lái)提供聚合酶。構(gòu)建了一株穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞系(Vero/pcDNA3-T7)，用于麻疹病毒的拯救過(guò)程。經(jīng)免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明在無(wú)選擇壓力情況下，連續(xù)傳40代(約120天)T7 RNA聚合酶基因在vero細(xì)胞中可以穩(wěn)定表達(dá)。將T7啟動(dòng)子控制下含有報(bào)告基因(EGFP)的表達(dá)質(zhì)粒pT7IP-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，綠色熒光蛋白能夠表達(dá)，表明表達(dá)出的蛋白具有

5、聚合酶的活性，能夠驅(qū)動(dòng)T7啟動(dòng)子下游基因的表達(dá)。將反向插入報(bào)告基因的微復(fù)制子質(zhì)粒PminiEGFP轉(zhuǎn)染已經(jīng)感染過(guò)麻疹病毒CC-47株的細(xì)胞Vero/pcDNA3-T7，細(xì)胞株中能夠檢測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)，與痘苗病毒-T7載體系統(tǒng)相比報(bào)告基因的拯救量增加，并且細(xì)胞無(wú)明顯死亡，顯示了拯救方法的優(yōu)越性。 麻疹病毒基因的轉(zhuǎn)錄起始于病毒基因組的3’端，聚合酶沿著基因起始(GS)和基因結(jié)束(GE)信號(hào)序列順序依次進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，每經(jīng)過(guò)一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水

6、平就會(huì)明顯下降。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的麻疹病毒全基因克隆進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化和修飾。首先將麻疹病毒N-P基因間結(jié)構(gòu)類似的GS和GE信號(hào)序列，插入到麻疹病毒基因組結(jié)構(gòu)基因P和M之間非必須區(qū)域，命名為NPaigr結(jié)構(gòu)，并在GS和GE之間引入多克隆位點(diǎn)以利于外源基因的引入。為驗(yàn)證合成的NPaigr結(jié)構(gòu)是否具有驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的功能，在麻疹病毒微復(fù)制子質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建雙順?lè)醋淤|(zhì)粒pMVaigrEGFP/HTNS，其結(jié)構(gòu)為：?jiǎn)?dòng)子-HamRz-MV 5’

7、Trailor-反向EGFP-NPaigr-反向漢灘病毒核蛋白基因(HTNS)-MV 3’Leader-HdvRz。結(jié)果表明，在MV預(yù)先感染的Vero/pcDNA3-T7細(xì)胞中，報(bào)告基因綠色熒光蛋白能夠表達(dá)，說(shuō)明NPaigr結(jié)構(gòu)能夠驅(qū)動(dòng)其下游的基因表達(dá)。然后將NPaigr結(jié)構(gòu)克隆到MV全基因組克隆中，將漢灘病毒84FLi的核蛋白的編碼區(qū)和報(bào)告基因EGFP分別插入到麻疹病毒全基因組表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成兩個(gè)重組麻疹病毒載體表達(dá)質(zhì)粒p

8、Rz8F7Raigr-HTNS和pRz8F7Raigr-EGFP，同時(shí)保證了插入后麻疹病毒全基因組堿基數(shù)是6的倍數(shù)。將上述2個(gè)質(zhì)粒分別與輔助質(zhì)粒麻疹病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-N、pcDNA3-P及pGEM3zf-L共轉(zhuǎn)染T7RNA聚合酶穩(wěn)定表達(dá)Vero細(xì)胞系Vero/pcDNA3-T7，經(jīng)過(guò)細(xì)胞傳代進(jìn)行麻疹病毒重組全基因組感染性克隆的拯救試驗(yàn)。在第二代細(xì)胞中經(jīng)過(guò)ELISA、免疫熒光、RT-PCR以及序列測(cè)定突變標(biāo)簽等方法鑒定有麻