抗FⅧ-C2區(qū)單克隆抗體的制備及功能研究.pdf

1、血栓性疾病嚴重威脅著人類的健康，血栓形成的機制和防治的研究是醫(yī)學科學領域重大課題之一。研究發(fā)現，FVIII水平升高已經成為動靜脈血栓形成的一個獨立危險因素，高水平的FVIII主要通過凝血途徑增加凝血酶和纖維蛋白形成率以及刺激凝血酶生成進一步引起血小板激活和纖維蛋白的形成等機制參與動靜脈血栓的形成。而且，研究發(fā)現FVIII水平降低對于缺血性心臟病有保護作用。在血友病A患者中由于缺血性心臟病死亡的人數明顯低于正常男性人群，這提示FVIII參

2、與了動脈血栓的發(fā)病機制。另一方面，對血友病A的患者觀察發(fā)現發(fā)生靜脈血栓的情況很少。這些結果均提示通過抑制FVIII活性來進行抗栓治療是可能的。 作為一種具有靶向性的生物大分子，單克隆抗體始終是人們關注的熱點之一，被廣泛用于治療腫瘤、病毒感染以及抗移植排斥等多種疾病。臨床應用取得了較好效果，顯示了單克隆抗體藥物治療疾病的良好前景。其所具有的特異性以及藥代動力學特征亦為預防和治療血栓性疾病提供了新的方向。FVIII-C2區(qū)含有與vW

3、F、PS、FXa以及凝血酶等蛋白結合的位點，具有重要的病理生理功能。因此，本研究制備了針對FVIII-C2區(qū)的單克隆抗體并對其功能及機制進行了研究。試驗分三部分：(1)在大腸桿菌中表達了FVIII-C2區(qū)蛋白并研究了其功能；(2)用rFVIII-C2區(qū)蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，經標準單克隆抗體技術制備并鑒定了一株FVIII-C2區(qū)單克隆抗體SZ-132；(3)研究了SZ-132抑制FVIII促凝活性，并通過研究SZ-132抑制r

4、hFVIII-vWF、rhFVIII-PS結合試驗以及SZ-132抑制rhFVIII與血小板的結合來闡明SZ-132抑制FVIII促凝活性的可能機制。 第一部分人 FVIII-C2區(qū)在大腸桿菌中的表達及功能研究 FVIII是內源性凝血途徑中一個重要的輔因子，其包涵2332個氨基酸。由A1-A2-A3-B-C1-C2結構域組成，其中C2區(qū)含有與血管性血友病因子(vWF)、磷脂(PL)等結合的位點。在血漿中，FVIII通過

5、非共價鍵與vWF結合避免其被降解，與血小板上磷脂膜的結合對于發(fā)揮FVIII的促凝作用至關重要。因此，FVIII-C2區(qū)對于維持FVIII的穩(wěn)定性以及活性具有重要的意義。本研究中采用PCR技術從含有hFVIII-cDNA的質粒中擴增出FVIII-C2區(qū)基因，經電泳及測序正確后，將其連接至原核表達載體pQE30中，構建出pQE30-FVIII-C2表達質粒，經ITPG誘導表達后，收集細菌反復凍融，超聲破菌，SDS-PAGE電泳觀察表達蛋白的

6、存在形式，用western blot方法鑒定表達的蛋白，應用金屬螯合層析法純化目的蛋白。ELISA法測定重組的FVIII-C2區(qū)蛋白與血管性血友病因子(vWF)和磷脂酰絲氨酸(PS)的結合。結果顯示，PCR反應擴增出489 bp的特異性片段，測序結果與已知的FVIII-C2區(qū)cDNA序列完全一致。重組的pQE30-FVIII-C2質粒轉染大腸桿菌M15，經ITPG誘導4-6 h后可高效表達目的蛋白，表達量占菌體總蛋白的48％左右，以包涵

7、體形式存在。Western blot結果顯示重組的蛋白能夠特異地和His抗體起反應。ELISA法測定重組蛋白與vWF和PS結果表明，該重組蛋白呈劑量依賴方式與vWF和PS結合，說明在FVIIIC2區(qū)含有與vWF和PS的結合位點。 第二部分抗FVIII-C2區(qū)特異性單克隆抗體SZ-132的研制和鑒定 FVIII水平升高已經成為動靜脈血栓形成的一個獨立危險因素。而且，研究發(fā)現FVIII水平降低對于缺血性心臟病有保護作用。在

8、血友病A患者中由于缺血性心臟病死亡的人數明顯低于正常男性人群，這提示FVIII參與了動脈血栓的發(fā)病機制。另一方面，對血友病A的患者觀察發(fā)現發(fā)生靜脈血栓的情況很少。這些結果均提示通過抑制FVIII活性來進行抗栓治療是可能的。單克隆抗體所具有的特異性以及藥代動力學特征亦為預防和治療血栓性疾病提供了新的方向。針對血液凝固途徑中的凝血因子(如組織因子TF、FIX以及FVIII等)的單克隆抗體的研制已經成為研究的熱點。鑒于FVIII-C2區(qū)所具有

9、的重要病理生理功能，本研究應用重組的FVIII-C2區(qū)蛋白作為抗原，免疫Balb/c小鼠，采用經典的雜交瘤融合技術制備抗FVIII-C2區(qū)的單克隆抗體，結果獲得了一株與FVIII-C2蛋白反應最強的單克隆抗體，命名為SZ-132。ELISA法及western blot結果顯示SZ-132能夠與rhFVIII及rFVIII-C2蛋白反應，提示SZ-132是針對FVIII-C2區(qū)的特異性單克隆抗體。 第三部分抗FVIII-C2區(qū)單克

10、隆抗體SZ-132的功能研究 已有研究發(fā)現，針對FVIII的單克隆抗體能夠抑制FVIII的促凝活性，在動物血栓模型實驗中能夠抑制血栓的形成。本研究在體外觀察了SZ-132對FVIII促凝活性的作用。將不同濃度的SZ-132與健康成人的混合血漿孵育后，當SZ-132濃度為0～25μg/ml時，該抗體呈劑量依賴的方式抑制FVIII活性；SZ-132對正常人新鮮混合血漿FVIII活性的抑制率為0～(95．00±3．12)％；濃度大于2

11、5μg/ml時，FVIII活性完全被抑制。IC50為7．96μg/ml。APTT測定顯示孵育后明顯延長，當濃度為0～25μg/ml時，APTT值為(33．4±9．8)s～(83．8±7．3)s。對照組SZ-123對FVIII活性及APTT均無影響(n=3)。為了研究SZ-132抑制FVIII活性的可能機制，本研究觀察了SZ-132對rhFVIII-vWF及rhFVIII-PS的結合的影響，結果發(fā)現SZ-132可以抑制上述結合反應，在SZ

12、-132對rhFVIII-vWF結合實驗的影響中，當SZ-132濃度為0～100μg/ml時，在490nm處測得的OD值為(3．28±0．45)～(0．24±0．12)；而SZ-132對rhFVIII-PS結合實驗的影響中，測得的OD值為(3．25±0．50)～(0．41±0．14)。對照組SZ-123對上述結合實驗無影響。(n=3)。IC50分別為10．71μg/ml和9．88μg/ml。該實驗解釋了SZ-132抑制FVIII活性的機

13、制，同時表明FVIII在vWF和PS上的結合位點相鄰或有重疊。本研究觀察了SZ-132對rhFVIII與血小板結合實驗的影響，結果發(fā)現SZ-132能夠以劑量依賴的方式抑制二者的結合。當SZ-132濃度為0～100μg/ml時，在490nm處測得的OD值為(2．65±0．25)～(0．56±0．10)。對照組SZ-123對二者結合無影響。(n=3)。上述結果表明，SZ-132是一株針對FVIII-C2區(qū)的抑制性單克隆抗體，其可能通過抑制r