小鼠抗登革病毒2型單克隆抗體的制備及特性的研究.pdf

1、登革病毒(Denguevirus，DV)是黃病毒科的單股正鏈RNA病毒，有4種血清型，均可以引起登革熱(Classicaldenguefever，DF)和登革出血熱/登革休克綜合征(Denguehemorrhagicfever/Dengueshocksyndrome，DHF/DSS)，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。每年DF病例超過(guò)1億，DHF病例約50萬(wàn)。WHO已將DHF/DSS、肝炎、瘧疾、結(jié)核列為全球流行最嚴(yán)重的傳染病。但DV的發(fā)病機(jī)

2、理不明，臨床治療也主要是支持對(duì)癥為主。 目前，關(guān)于DHF/DSS發(fā)病機(jī)制的看法主要有三種：①抗體依賴(lài)增強(qiáng)(Antibody-dependentenhancement，ADE)理論：認(rèn)為DV特異性IgG所引起的免疫增強(qiáng)效應(yīng)導(dǎo)致出現(xiàn)DHF/DSS的病理變化；②病毒因素致病理論：認(rèn)為病毒毒力或復(fù)制能力等因素是導(dǎo)致嚴(yán)重疾病的原因；③免疫病理反應(yīng)理論：認(rèn)為交叉反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫損傷是DHF/DSS的主要病理機(jī)制。有人甚至認(rèn)為，高病

3、毒滴度、再次感染和DV2是發(fā)生DHF/DSS的三個(gè)主要因素。而疫苗研究重點(diǎn)集中在研制四價(jià)疫苗，希望能同時(shí)抵抗四型DV的感染，減毒四價(jià)活疫苗曾一度被認(rèn)為是最具前景的候選疫苗。但迄今為止，仍然沒(méi)有獲得既安全又有效的疫苗。 基于近年來(lái)DHF/DSS患者數(shù)明顯增加和臨床上無(wú)有效防治手段的現(xiàn)狀，被動(dòng)免疫或者說(shuō)是治療性抗體策略引起了研究者的關(guān)注。這種方法早在19世紀(jì)末就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用，在20世紀(jì)30年代被廣泛使用，但由于當(dāng)時(shí)的抗體制備水平有

4、限和免疫知識(shí)背景的缺乏，這一方法在40年代被禁止。近年來(lái)，抗體技術(shù)在制備、純化或人源化等方面均取得了較大的進(jìn)步，被動(dòng)免疫治療或者治療性抗體的策略再次成為焦點(diǎn)。大量的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均已證明：抗體尤其是中和抗體能有效阻止病毒感染宿主細(xì)胞。所以，無(wú)論從研究DV病理機(jī)制角度，還是從研發(fā)疫苗角度，獲得高質(zhì)量的特異性抗體具有重要意義。 本試驗(yàn)以傳統(tǒng)方法制備登革病毒2型(Denguevirustype2，DV2)Tr1751株的小鼠單克隆抗體

5、(Monoclonalantibodies，mAb)，并鑒定其特性，期望能獲得多株抗DV的mAb，為后續(xù)研究DV的致病機(jī)理，以及疫苗的研發(fā)提供初步的免疫學(xué)工具。 本研究主要結(jié)果與結(jié)論如下：1.獲得了三株分泌DV特異性mAb的雜交瘤細(xì)胞株：本實(shí)驗(yàn)以含高滴度DV2的Blab/c乳鼠腦勻漿為免疫原，按步驟多次免疫Blab/c小鼠。用PEG4000將免疫小鼠脾細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，再采用HAT培養(yǎng)液篩選，存活的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆

6、化培養(yǎng)，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)確定陽(yáng)性株。之后反復(fù)采用細(xì)胞記數(shù)稀釋法和ELISA進(jìn)行篩選，直至陽(yáng)性率為100％，從而獲得分泌DV特異性mAb的雜交瘤細(xì)胞系。各經(jīng)5次克隆化后，獲得了3株穩(wěn)定分泌mAb的雜交瘤細(xì)胞系，分別命名為B152、I1、I9。 2.間接免疫熒光染色證實(shí)mAb的特異性：本實(shí)驗(yàn)針對(duì)三株mAb分別設(shè)置了一般感染組和正常對(duì)照組，即分別將感染和

7、未感染DV2的ECV304細(xì)胞固定在玻片上進(jìn)行染色。以腹水mAb為一抗，羊抗小鼠IgG-FITC為二抗，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。一般感染組中病毒抗原被強(qiáng)染，病毒抗原多集中在細(xì)胞質(zhì)的一側(cè)，呈“火焰”狀、“流星”狀，還有分布于核周的病毒抗原有時(shí)也被強(qiáng)染。而正常對(duì)照組中，均無(wú)特異性染色出現(xiàn)。陽(yáng)性對(duì)照(小鼠抗DV2血清為一抗)的一般感染組中強(qiáng)染的病毒抗原在形態(tài)和分布上都與mAb相似，但熒光亮度更強(qiáng)，進(jìn)一步確證了mAb的特異性。 另外，在腹水

8、mAbB152染色中還發(fā)現(xiàn)，除分布于核周的病毒抗原外，還有病毒以外的細(xì)胞成分被強(qiáng)染，陽(yáng)性反應(yīng)呈線(xiàn)性和網(wǎng)狀分布于細(xì)胞胞漿區(qū)，類(lèi)似細(xì)胞的微絲骨架，而且在未感染DV2的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了線(xiàn)性和網(wǎng)狀的微絲樣著色。利用mAbB152和Phallodin-TRITC(特異性顯示微絲)進(jìn)行雙染色，發(fā)現(xiàn)病毒感染后出現(xiàn)的環(huán)狀微絲可同時(shí)被mAbB152強(qiáng)染。所以，該株抗體可能既識(shí)別病毒抗原，也識(shí)別細(xì)胞骨架的微絲成分。 3.PRNT證明mAb具有中和特性

9、：將VERO細(xì)胞接種于24孔板，生長(zhǎng)至單層。將已測(cè)定滴度為9×105PFU/ml的DV2稀釋到約90PFU/0.1ml。設(shè)腹水單抗組和正常小鼠血清組進(jìn)行噬斑減少分析，每組按1：10、1：40、1：100、1：160、1：640的比例分別稀釋。取稀釋的病毒液0.5ml和各稀釋度的腹水單抗或正常小鼠血清0.5ml混勻，37℃水浴1h，感染培養(yǎng)于24孔板的VERO細(xì)胞，約7～8d后結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)PFU發(fā)現(xiàn)：陽(yáng)性對(duì)照孔的平均PFU為90；陰性對(duì)

10、照孔PFU均為0；加腹水單抗組PFU均有不同程度的減少，并且隨抗體濃度增加而明顯；正常鼠血清對(duì)照組在1：10濃度時(shí)，也對(duì)PFU有較大的影響。但在1：40及其以上稀釋度時(shí)，對(duì)PFU則無(wú)明顯影響。說(shuō)明三株腹水mAb都對(duì)DV2有中和作用。計(jì)算三株mAb的50％噬斑阻斷濃度(50％plaqueinhibitionconcentration，IC50)：I1在1：160左右，I9在1：100左右，B152在1：40左右。 4.Wester

11、nblot證明mAb識(shí)別DVE蛋白的抗原表位：本實(shí)驗(yàn)設(shè)檢驗(yàn)組和對(duì)照組：檢驗(yàn)組為濃縮的DV2樣本，對(duì)照組為C6/36細(xì)胞樣本。各樣本經(jīng)SDS-PAGE后，凝膠轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上。三株腹水mAb分別為一抗，并設(shè)小鼠抗DV2血清為陽(yáng)性對(duì)照、不加抗體為二抗本底對(duì)照。以HRP標(biāo)記的羊抗小鼠血清為二抗，DAB顯色。(1)不加一抗的檢驗(yàn)組和對(duì)照組均無(wú)顯色；(2)小鼠抗血清的檢驗(yàn)組有多條顯色條帶，而對(duì)照組無(wú)顯色；(3)mAb組：對(duì)照組無(wú)顯色，而檢驗(yàn)組只